※ 引述《owl628 (owl628)》之铭言： : 最近学用DIG合成probe去做Southern : 但是压出来的结果有很多杂band : 而且major band并不是我要的band : 想了一下如何降低background : 想到 : 1.增加probe长度(原本是500bp) : 2.增加pre-hybridation的时间(原本是一小时) : 3.增加wash的时间跟温度 : 注:上述条件大部分是照Roche的kit做的 : 想说板上有没有人有类似的问题 : 不知道除了我举的那三点还有没有哪里可以改进 : 或是那三点改进有用吗??? : 麻烦大家了,谢谢~ 首先 southern 真的是超难做的实验, 好吧 其实是繁琐 正冲我的急躁 过程是重重考验~ 科科 ~ 所以第一个建议是.....别急...一步步紮紮实实往下作 -------------------------------------- 实验部分: 1. 南方转渍 要注意的有 a. DIG labeling band shift是不是有符合预期,DIG-dU的比例 (PCR法) 如果吃饱太闲有人甚至还会纯化过 科科 b. DNA的脢切~影响脢切的因素有没有排除, 切完之後的 DNA ladder...等等 c. 架盐桥之前的buffer wash ..... 淦 I hate those so much. (切记...用那种membrane就根据原厂建议的buffer浓度) 以上请自行确认~并小心操作 -------------------------------------- 根据您的叙述 我认为 背景值除非深到影响判读~ 否则....跟结果不符预期是两回事 背景太深...跟probe长度 或 pre-hy时间 我认为 无关 跟 probe loading 的量, wash的条件,与曝光时间长短 有关 probe 该下多少 请参考罗氏说明书<<<<大本的那种,上头好像还有只青蛙照片 该用怎样的条件wash, molecular cloning 有写 曝光 就交给机器吧~ 我是用CCD侦测+电脑控制>>data 是 jpg or tif 所以我都放心的出去玩 科科 至於与结果不符预期~我认为... 如果不是DNA没切好 大概是..................anyway...就在重头推算一次 搜寻一下probe的叙列 搞不好 probe内含一段太过於保守的片段 以致乱粘 可能您後来会吓一跳 目前的结果 其实是*可以 符合预期的* 所以~ 虽然我认为500bp 应该是够了~ 但是probe搞长点~应该也不赖 总之再次确认之後 您自然会有所取舍 --

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