作者calmato (Anita~)
看板Biotech
標題Re: [求救]請問PCR products用restriction enzymeꐠ…
時間Thu Aug 14 11:04:01 2008
※ 引述《albertwang (會思考的魚)》之銘言：
: ※ 引述《calmato (Anita~)》之銘言：
: :
不好意思~因為我是第一次接觸分生~很多東西都是自己try
或找資料或問人~所以有很多東西~不知該怎麼問或該注意什麼
~所以真的很不好意思~遇到很多問題卻自己一直沒法解決 >"<
廠商給的information 是只有說 To make 100uM stock solution
add 255 ul of buffer
我的working primer是從這裡面取10ul primer + 90 ul water
那我把我的所有try的條件po上來~但不知道這樣是不是您說的反應條件?
跑PCR ，total volume 30，water 19.85，primer Forward and reverse
各1，10x dNTP 3，10xPCR buffer 3 ，Taq 0.15 ，Template DNA 2
以上單位都是ul。但我的DNA濃度品質不一~OD從 40~800 ng/ul
使用restrition enzyme: PCR products 5，water 16.4，10x Buffer 2
50X SAM 0.6，enzyme 1；total volume 25，使用的廠牌是Fermentas
它的protocal是PCR reaction mixture 10ul(~0.1-0.5ug of DNA)
water 18 ，10X Buffer Tango 2，50XSAM 0.6，enzyme 1-2
因為考量到我的PCR products加10會切不完整，~所以才加5，但照我的想法
我的DNA量不算太少，切出來應該會很清楚，但不知為何拍出來照片都很淡
我一直找不出原因。
也想請問您剛說用酒精沉澱，是如何做呢?
以上很冗長，感謝您的指教!!
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◆ From: 140.128.68.5
1F：推 yaliu:其實純化DNA kit也沒有很貴說，用這個比較方便啦 08/14 11:25
2F：→ yaliu:酒精沈澱就是加絕對冰酒精跟高鹽溶液（詳細比例忘了..） 08/14 11:26
3F：→ yaliu:然後放冰上久一點，DNA就會沈澱下來...不過這樣primer還是無 08/14 11:28
4F：→ yaliu:法去除說...而且你的片段很小，可能也不好沈澱吧 08/14 11:28
5F：推 sGoat:酒精沉澱加入兩倍體積100%酒精,放1-2小時後離心,再加70%酒精 08/14 23:25
6F：→ sGoat:wash DNA ,1/10 3M NaOAc可加可不加(100%沉澱效果不好再加) 08/14 23:27
7F：→ sGoat:另外要切Product的話最好確定每次切的量有1ug以上 08/14 23:30
8F：→ sGoat:還有想請問一下切完你要作什麼呢?(好奇 08/14 23:30