作者calmato (Anita~)
看板Biotech
标题Re: [求救]请问PCR products用restriction enzymeꐠ…
时间Thu Aug 14 11:04:01 2008
※ 引述《albertwang (会思考的鱼)》之铭言：
: ※ 引述《calmato (Anita~)》之铭言：
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不好意思~因为我是第一次接触分生~很多东西都是自己try
或找资料或问人~所以有很多东西~不知该怎麽问或该注意什麽
~所以真的很不好意思~遇到很多问题却自己一直没法解决 >"<
厂商给的information 是只有说 To make 100uM stock solution
add 255 ul of buffer
我的working primer是从这里面取10ul primer + 90 ul water
那我把我的所有try的条件po上来~但不知道这样是不是您说的反应条件?
跑PCR ，total volume 30，water 19.85，primer Forward and reverse
各1，10x dNTP 3，10xPCR buffer 3 ，Taq 0.15 ，Template DNA 2
以上单位都是ul。但我的DNA浓度品质不一~OD从 40~800 ng/ul
使用restrition enzyme: PCR products 5，water 16.4，10x Buffer 2
50X SAM 0.6，enzyme 1；total volume 25，使用的厂牌是Fermentas
它的protocal是PCR reaction mixture 10ul(~0.1-0.5ug of DNA)
water 18 ，10X Buffer Tango 2，50XSAM 0.6，enzyme 1-2
因为考量到我的PCR products加10会切不完整，~所以才加5，但照我的想法
我的DNA量不算太少，切出来应该会很清楚，但不知为何拍出来照片都很淡
我一直找不出原因。
也想请问您刚说用酒精沉淀，是如何做呢?
以上很冗长，感谢您的指教!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.68.5
1F：推 yaliu:其实纯化DNA kit也没有很贵说，用这个比较方便啦 08/14 11:25
2F：→ yaliu:酒精沈淀就是加绝对冰酒精跟高盐溶液（详细比例忘了..） 08/14 11:26
3F：→ yaliu:然後放冰上久一点，DNA就会沈淀下来...不过这样primer还是无 08/14 11:28
4F：→ yaliu:法去除说...而且你的片段很小，可能也不好沈淀吧 08/14 11:28
5F：推 sGoat:酒精沉淀加入两倍体积100%酒精,放1-2小时後离心,再加70%酒精 08/14 23:25
6F：→ sGoat:wash DNA ,1/10 3M NaOAc可加可不加(100%沉淀效果不好再加) 08/14 23:27
7F：→ sGoat:另外要切Product的话最好确定每次切的量有1ug以上 08/14 23:30
8F：→ sGoat:还有想请问一下切完你要作什麽呢?(好奇 08/14 23:30