作者tsubasawolfy (悠久の翼)
看板Biotech
標題Re: [求救] IPTG誘導E.coli產生綠螢光
時間Sat Jul 26 11:46:16 2008
※ 引述《onlyone0419 (期待)》之銘言：
: 由於這株菌是別的實驗室給的(要拿來做phagocytosis)
: 目前聯略不到給我這株菌的學長@@
: 只知道當初說要加 1mM 的 IPTG 來誘導
: 請問有大大知道
: 是要養菌的時候就直接加下去嗎?
: 還有是要誘導多久 = =
: 怕養太久會產生太多protein
: 感激<(__ __)>
: ps:老師說養太久會產生太多蛋白或是菌會太老...
: 可是我只養10小時啊@.@...會太久嗎? 我看很多人都是養10小時以上
: 0rz
最普通的方法...
1.先用養菌管養你的菌養充足 (這看各個實驗室傳承的時間 科科)
2.抽取適當的菌液量到你準備induction的培養瓶中 加之前取1mL當測OD的blank
(抽多少量...一樣看你們實驗室前人經驗 沒有的話去找vetor製作商
應該都有online protocol)
之後每隔一段時間測OD600
OD值大概0.4-0.6就會加入IPTG(這也是看各實驗室或看vector)
ps 1.2步驟都要加antibiotic
3.加入IPTG
4.加入後每隔一小時取1mL 起來離心收pellet (收完記得插冰上..)
5.通常大概4-6小時(看vector能力..) protein就應該已經最大量
6.把步驟三的那些pellet拿去跑SDS-PAGE 然後染膠
(最便宜的Commasive blue應該就好了 要用silver or sybro你高興就好ˋ(′_‵||)ˊ)
看你的protein在第幾個時間點就達到最大量 之後就用那個時間點就好
pellet怎麼跑的話....1XSDS sample buffer加下去攪一攪煮一煮就可以load well
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◆ From: 163.15.174.201
1F：推 onlyone0419:感激<(__ __)> 07/26 12:02
2F：推 nightcatman:這篇很實用 07/26 17:58
3F：推 stanley300:好文~推 07/27 23:58
4F：推 hurdle:步驟六應該要用Western blot去鑑定 07/29 12:10
5F：→ hurdle:不然整個沒純化過的bacteria lysate, protein會一大堆 07/29 12:11
6F：→ tsubasawolfy:p是會一堆band 但是只要知道自己蛋白的位置並觀察 07/29 18:16
7F：→ tsubasawolfy:粗細變化就知道是哪一個 07/29 18:16