作者anne74129 (絕對蘿莉正太控)
看板Biotech
標題[求救] 細菌突變後又回復成野生株
時間Mon Jul 7 19:13:59 2008
各位好
小妹我目前遇到一個瓶頸
目前我在做的是細菌的deletion mutant
但是不管我怎麼做 我所挑到的突變株
養到第二代就全部回復成wild type
一開始以為是汙染問題
所以我都盡可能挑取single colony來培養
而且將所有會用到的藥品全部更新
看了一些paper後 方式也稍微更改
但是所得的結果仍然一樣0rz…
而曾經做過這個實驗的學長 他說他一次就OK
所以他也不知道我的問題到底出在哪
我已經做到心灰意冷了……
因此我想請問板上的各位
有沒有什麼意見跟指教 能夠給我一些建議
我簡述一下我的實驗方法(有修正)
我是利用帶有缺陷基因的suicide vector
(含有sac gene會分解sucrose 會產生有毒物質來毒殺細菌)
在培養基內加入抗生素迫使suicide vector插入目標基因內
(因為suicide vector上的缺陷基因會和細菌本身的目標基因前後兩端相同
再加上此vector無法在host體內複製 傳到下一代
因此 如果vector沒有插入目標基因 host就無法存活在含有抗生素的plate上)
再利用sucrose使suicide vector跳出時 將目標基因帶出
(也就是利用double crossover的方式產生deletion mutant)
放圖比較清楚
http://www.pixnet.net/photo/ramonaanne/95399033
我是使用colony PCR方式篩選
(若為deletion mutant片段大小為800bp wild type為2.6Kb)
第一次我都能篩到mutant
但經過培養 再進行PCR後
卻全部回復成wild type
前面步驟一切順利 但總在最後一步出問題
還有 目標基因非essential gene
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.78.31
※ 編輯: anne74129 來自: 140.112.78.31 (07/07 20:56)
1F：推 milkpa:PCR時可能會把plasmid當成template不是嗎？另外，進行 07/07 22:37
2F：→ milkpa:insertion/deletion是用同源互換或者是用recombinase？ 07/07 22:37
3F：→ milkpa:抗生素只能表示該抗性基因能表現，不代表有插進去 07/07 22:38
4F：→ milkpa:或者有做plasmid loss的部分，但是丟不乾淨？ 07/07 22:39
是利用同源互換
此外plasmid無法在我的host內自行複製 因此應該不會丟不乾淨(我會培養2-3代)
5F：推 davideason:1F點出您實驗的2個盲點,另外加抗生素可以使質體插入 07/07 22:49
6F：→ davideason:細菌的DNA?真的沒聽過,如有請不吝指教(我不是作微生的) 07/07 22:51
7F：→ davideason:聽起來真有趣 07/07 22:51
8F：→ davideason:如果質體插入DNA可用Inverse PCR檢測<<<可能有點麻煩 07/07 22:53
9F：→ davideason:I-PCR可以定序得知哪個基因被插壞了 07/07 22:55
方法已修正 不好意思我講的不清不楚的
謝謝兩位的指教
※ 編輯: anne74129 來自: 140.112.78.31 (07/08 10:21)
※ 編輯: anne74129 來自: 140.112.78.31 (07/08 10:30)
※ 編輯: anne74129 來自: 140.112.78.31 (07/08 10:31)
10F：推 davideason:事出必有因,您可以先去NCBI下載質體檔案丟到vector NTI 07/08 15:28
11F：→ davideason:先確定有沒有ori或是奇怪的序列在質體上,一步一步 07/08 15:30
12F：→ davideason:紮紮實實把實驗做好 07/08 15:30
13F：→ davideason:我猜想有沒有ori應該是關鍵 07/08 15:32
14F：推 ROKEE:哇...我想把sac轉殖到我身上全部的脂肪細胞裡 07/08 17:08
15F：→ ROKEE:這樣吃越多糖我就會越瘦XDDD 07/08 17:08
16F：推 milkpa:要不要考慮丟一個帶有recombinase的help plasmid？ 07/08 23:21
17F：推 milkpa:同時在第一次重組時目標基因不就已經被置換掉了，取而代之 07/08 23:23
18F：→ milkpa:的是Cm(r)，另外，您如何確定plasmid無法在host中複製？ 07/08 23:24
19F：→ milkpa:ok,看到了，R6K ori，的確在一般的host中不會複製 07/08 23:25
20F：→ milkpa:但是您的Cm篩選也需要注意，Cm的background noise有時還 07/08 23:26
21F：→ milkpa:蠻高的，PCR也可以做+以及-的控制組以防萬一。或者先夾 07/08 23:28
22F：→ milkpa:外面再夾裡面也能做double check 07/08 23:29
23F：推 milkpa:找了一些資料，他的第二次重組是不是會出現兩種狀況？ 07/08 23:46
24F：→ milkpa:一種是出現妳要的，一種就是回復WT，也許要篩選的嚴一點 07/08 23:48
25F：→ milkpa:您自己的slide不也出現兩種可能？ 07/08 23:48
26F：推 ROKEE:給樓上 原po是指他利用PCR check後的mutant在sub後... 07/08 23:51
27F：→ ROKEE:發現塞進去的東西不見了 變成根WT一樣 07/08 23:52