作者anne74129 (绝对萝莉正太控)
看板Biotech
标题[求救] 细菌突变後又回复成野生株
时间Mon Jul 7 19:13:59 2008
各位好
小妹我目前遇到一个瓶颈
目前我在做的是细菌的deletion mutant
但是不管我怎麽做 我所挑到的突变株
养到第二代就全部回复成wild type
一开始以为是污染问题
所以我都尽可能挑取single colony来培养
而且将所有会用到的药品全部更新
看了一些paper後 方式也稍微更改
但是所得的结果仍然一样0rz…
而曾经做过这个实验的学长 他说他一次就OK
所以他也不知道我的问题到底出在哪
我已经做到心灰意冷了……
因此我想请问板上的各位
有没有什麽意见跟指教 能够给我一些建议
我简述一下我的实验方法(有修正)
我是利用带有缺陷基因的suicide vector
(含有sac gene会分解sucrose 会产生有毒物质来毒杀细菌)
在培养基内加入抗生素迫使suicide vector插入目标基因内
(因为suicide vector上的缺陷基因会和细菌本身的目标基因前後两端相同
再加上此vector无法在host体内复制 传到下一代
因此 如果vector没有插入目标基因 host就无法存活在含有抗生素的plate上)
再利用sucrose使suicide vector跳出时 将目标基因带出
(也就是利用double crossover的方式产生deletion mutant)
放图比较清楚
http://www.pixnet.net/photo/ramonaanne/95399033
我是使用colony PCR方式筛选
(若为deletion mutant片段大小为800bp wild type为2.6Kb)
第一次我都能筛到mutant
但经过培养 再进行PCR後
却全部回复成wild type
前面步骤一切顺利 但总在最後一步出问题
还有 目标基因非essential gene
谢谢
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.78.31
※ 编辑: anne74129 来自: 140.112.78.31 (07/07 20:56)
1F：推 milkpa:PCR时可能会把plasmid当成template不是吗？另外，进行 07/07 22:37
2F：→ milkpa:insertion/deletion是用同源互换或者是用recombinase？ 07/07 22:37
3F：→ milkpa:抗生素只能表示该抗性基因能表现，不代表有插进去 07/07 22:38
4F：→ milkpa:或者有做plasmid loss的部分，但是丢不乾净？ 07/07 22:39
是利用同源互换
此外plasmid无法在我的host内自行复制 因此应该不会丢不乾净(我会培养2-3代)
5F：推 davideason:1F点出您实验的2个盲点,另外加抗生素可以使质体插入 07/07 22:49
6F：→ davideason:细菌的DNA?真的没听过,如有请不吝指教(我不是作微生的) 07/07 22:51
7F：→ davideason:听起来真有趣 07/07 22:51
8F：→ davideason:如果质体插入DNA可用Inverse PCR检测<<<可能有点麻烦 07/07 22:53
9F：→ davideason:I-PCR可以定序得知哪个基因被插坏了 07/07 22:55
方法已修正 不好意思我讲的不清不楚的
谢谢两位的指教
※ 编辑: anne74129 来自: 140.112.78.31 (07/08 10:21)
※ 编辑: anne74129 来自: 140.112.78.31 (07/08 10:30)
※ 编辑: anne74129 来自: 140.112.78.31 (07/08 10:31)
10F：推 davideason:事出必有因,您可以先去NCBI下载质体档案丢到vector NTI 07/08 15:28
11F：→ davideason:先确定有没有ori或是奇怪的序列在质体上,一步一步 07/08 15:30
12F：→ davideason:紮紮实实把实验做好 07/08 15:30
13F：→ davideason:我猜想有没有ori应该是关键 07/08 15:32
14F：推 ROKEE:哇...我想把sac转殖到我身上全部的脂肪细胞里 07/08 17:08
15F：→ ROKEE:这样吃越多糖我就会越瘦XDDD 07/08 17:08
16F：推 milkpa:要不要考虑丢一个带有recombinase的help plasmid？ 07/08 23:21
17F：推 milkpa:同时在第一次重组时目标基因不就已经被置换掉了，取而代之 07/08 23:23
18F：→ milkpa:的是Cm(r)，另外，您如何确定plasmid无法在host中复制？ 07/08 23:24
19F：→ milkpa:ok,看到了，R6K ori，的确在一般的host中不会复制 07/08 23:25
20F：→ milkpa:但是您的Cm筛选也需要注意，Cm的background noise有时还 07/08 23:26
21F：→ milkpa:蛮高的，PCR也可以做+以及-的控制组以防万一。或者先夹 07/08 23:28
22F：→ milkpa:外面再夹里面也能做double check 07/08 23:29
23F：推 milkpa:找了一些资料，他的第二次重组是不是会出现两种状况？ 07/08 23:46
24F：→ milkpa:一种是出现你要的，一种就是回复WT，也许要筛选的严一点 07/08 23:48
25F：→ milkpa:您自己的slide不也出现两种可能？ 07/08 23:48
26F：推 ROKEE:给楼上 原po是指他利用PCR check後的mutant在sub後... 07/08 23:51
27F：→ ROKEE:发现塞进去的东西不见了 变成根WT一样 07/08 23:52