作者owl628 (owl628)
看板Biotech
標題[求救] cloning的問題
時間Thu Jul 3 11:55:41 2008
小弟我在做pET-32a及pGEX的clone
分別接上1.5kb及2.0kb的片段
希望讓蛋白接上不同的tag
但是挑了好多都挑不到想要的colony
amp plate沒有問題 因為有做過negative control
一顆都沒有長
而有transformation的菌長的滿多也滿漂亮的
但是就是怎麼都挑不到 想請問一下
是這兩個vector本來就不好挑嗎???
還是我自己的問題 謝謝~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.139.218
1F：推 liuse:這兩種vector很常用很好挑阿 實驗細節PO一下吧 07/03 13:49
2F：→ owl628:不好意思~可以請問一下樓上PO哪些細節比較有幫助呢?感謝^^ 07/03 14:02
3F：推 jjogp:vecter only長幾顆呢? 07/03 14:52
4F：→ owl628:我把原本的vector做transform,長的滿多的,密密麻麻的,謝謝~ 07/03 14:57
5F：→ FUSION87:Negative Control長很多的話 Vector沒處理好嗎??? 07/03 15:41
6F：推 MrCAKE:vector only是只把已經切開過的vector再拿去ligate喔 07/03 15:42
7F：→ owl628:sorry因為我是用兩個不同的切點去接,所以沒有做vector only 07/03 16:54
8F：推 sGoat:vector切完有純化嗎還是直接加片段ligation?有算接合比率嗎? 07/03 20:19
9F：→ owl628:有做膠回收,比率1比3到1比8左右都試過了,謝謝大家^^ 07/03 21:55
10F：推 jjogp:因為怕enzyme digest不完全 所以vector only作一下比較好喔 07/04 01:02
11F：推 sGoat:同意jjogp,double digestion完作個vector only吧...確定有切 07/04 01:07
12F：→ sGoat:另外要ligation之前將vector 75度heat一下再加進去會比較好. 07/04 01:10
13F：→ owl628:樓上是說將處理好的vector heat一下嗎???請問大概多久呢?? 07/04 13:09
14F：→ owl628:還有可以請問這樣的目的為何嗎???謝謝大家的意見喔^^ 07/04 13:10
15F：推 sGoat:大概五分鐘,避免黏回去或是二級結構... 07/04 16:21