作者owl628 (owl628)
看板Biotech
标题[求救] cloning的问题
时间Thu Jul 3 11:55:41 2008
小弟我在做pET-32a及pGEX的clone
分别接上1.5kb及2.0kb的片段
希望让蛋白接上不同的tag
但是挑了好多都挑不到想要的colony
amp plate没有问题 因为有做过negative control
一颗都没有长
而有transformation的菌长的满多也满漂亮的
但是就是怎麽都挑不到 想请问一下
是这两个vector本来就不好挑吗???
还是我自己的问题 谢谢~
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◆ From: 140.128.139.218
1F：推 liuse:这两种vector很常用很好挑阿 实验细节PO一下吧 07/03 13:49
2F：→ owl628:不好意思~可以请问一下楼上PO哪些细节比较有帮助呢?感谢^^ 07/03 14:02
3F：推 jjogp:vecter only长几颗呢? 07/03 14:52
4F：→ owl628:我把原本的vector做transform,长的满多的,密密麻麻的,谢谢~ 07/03 14:57
5F：→ FUSION87:Negative Control长很多的话 Vector没处理好吗??? 07/03 15:41
6F：推 MrCAKE:vector only是只把已经切开过的vector再拿去ligate喔 07/03 15:42
7F：→ owl628:sorry因为我是用两个不同的切点去接,所以没有做vector only 07/03 16:54
8F：推 sGoat:vector切完有纯化吗还是直接加片段ligation?有算接合比率吗? 07/03 20:19
9F：→ owl628:有做胶回收,比率1比3到1比8左右都试过了,谢谢大家^^ 07/03 21:55
10F：推 jjogp:因为怕enzyme digest不完全 所以vector only作一下比较好喔 07/04 01:02
11F：推 sGoat:同意jjogp,double digestion完作个vector only吧...确定有切 07/04 01:07
12F：→ sGoat:另外要ligation之前将vector 75度heat一下再加进去会比较好. 07/04 01:10
13F：→ owl628:楼上是说将处理好的vector heat一下吗???请问大概多久呢?? 07/04 13:09
14F：→ owl628:还有可以请问这样的目的为何吗???谢谢大家的意见喔^^ 07/04 13:10
15F：推 sGoat:大概五分钟,避免黏回去或是二级结构... 07/04 16:21