作者katty7389 (..............)
看板Biotech
標題[求救]有關RT-PCR調勻GAPDH的方法
時間Mon Jun 23 01:11:58 2008
大家好,最近我開始學習到RT-PCR的這項技術
不過實驗總是卡在一個環節好久一段時間
在RT做完之後轉成的cDNA拿去跑GADPH
雖然在轉RT前已經盡量準確的測量濃度
但跑出的電泳圖還是明亮不一
為了在同濃度的GADPH下去跑其他基因
我不得已跑了一次又一次的重跑PCR
但是PCR時要加多少體積的cDNA實驗室學長的建議
是看圖憑經驗要加多少
請問各位,有比較有技巧的方法,可以不用看圖猜要加多少量的cDNA
才能準確的調勻,或知道加多少cDNA
這裡是我的電泳圖,在跑PCR前我已儘量將濃度調到大約20ng/μl,然後我沒個都加4λ
跑PCR:
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=applekate&b=13&f=1134192604&p=0
我已經試過用image J看band的亮度做比較,不過似乎也沒有用
請大家幫我解答
謝謝!!
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◆ From: 220.141.11.101
※ 編輯: katty7389 來自: 220.141.11.101 (06/23 01:15)
1F：推 zoom8080:RNA quality可能要好一點 06/23 03:10
2F：推 sGoat:如果這幾管是分別跑RT的那就沒辦法,因為牽涉到每管效率不同 06/23 11:30
3F：→ sGoat:跑膠定量可能已經是最準的辦法了 06/23 11:30
4F：推 sisyphus:RT-PCR要定量本來就有點靠運氣~既然有影像分析軟體 06/24 08:47
5F：→ sisyphus:就把GADPH的強度當分母約分~不同組的表現就可以比較了 06/24 08:48
6F：→ sisyphus:以你的圖來說 除了最後一個太低 其他組都可以這樣比 06/24 08:49
7F：→ sisyphus:另外PCR反應有可能會飽和 所以cyle數要多試幾個 06/24 08:50
8F：→ sisyphus:你的cycles數好像都太高 所以band有點爆掉了 06/24 08:51
9F：→ sisyphus:試試看少個5~10吧 06/24 08:51
10F：→ katty7389:請問PCR反應怎麼看知道他爆掉,是因為BAND看起來很濃嗎? 06/24 10:47
11F：→ katty7389:還有,最近跑出的BAND上游又會出現淡淡比較大的BAND 06/24 11:20
12F：→ katty7389:請問是condition不OK的關係嗎 06/24 11:21
15F：推 zoom8080:有雜band就加一下annealing溫度吧 06/25 03:16