作者katty7389 (..............)
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标题[求救]有关RT-PCR调匀GAPDH的方法
时间Mon Jun 23 01:11:58 2008
大家好,最近我开始学习到RT-PCR的这项技术
不过实验总是卡在一个环节好久一段时间
在RT做完之後转成的cDNA拿去跑GADPH
虽然在转RT前已经尽量准确的测量浓度
但跑出的电泳图还是明亮不一
为了在同浓度的GADPH下去跑其他基因
我不得已跑了一次又一次的重跑PCR
但是PCR时要加多少体积的cDNA实验室学长的建议
是看图凭经验要加多少
请问各位,有比较有技巧的方法,可以不用看图猜要加多少量的cDNA
才能准确的调匀,或知道加多少cDNA
这里是我的电泳图,在跑PCR前我已尽量将浓度调到大约20ng/μl,然後我没个都加4λ
跑PCR:
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=applekate&b=13&f=1134192604&p=0
我已经试过用image J看band的亮度做比较,不过似乎也没有用
请大家帮我解答
谢谢!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.141.11.101
※ 编辑: katty7389 来自: 220.141.11.101 (06/23 01:15)
1F：推 zoom8080:RNA quality可能要好一点 06/23 03:10
2F：推 sGoat:如果这几管是分别跑RT的那就没办法,因为牵涉到每管效率不同 06/23 11:30
3F：→ sGoat:跑胶定量可能已经是最准的办法了 06/23 11:30
4F：推 sisyphus:RT-PCR要定量本来就有点靠运气~既然有影像分析软体 06/24 08:47
5F：→ sisyphus:就把GADPH的强度当分母约分~不同组的表现就可以比较了 06/24 08:48
6F：→ sisyphus:以你的图来说 除了最後一个太低 其他组都可以这样比 06/24 08:49
7F：→ sisyphus:另外PCR反应有可能会饱和 所以cyle数要多试几个 06/24 08:50
8F：→ sisyphus:你的cycles数好像都太高 所以band有点爆掉了 06/24 08:51
9F：→ sisyphus:试试看少个5~10吧 06/24 08:51
10F：→ katty7389:请问PCR反应怎麽看知道他爆掉,是因为BAND看起来很浓吗? 06/24 10:47
11F：→ katty7389:还有,最近跑出的BAND上游又会出现淡淡比较大的BAND 06/24 11:20
12F：→ katty7389:请问是condition不OK的关系吗 06/24 11:21
15F：推 zoom8080:有杂band就加一下annealing温度吧 06/25 03:16