作者davideason (Davideason)
看板Biotech
標題Re: [求救] touchdown pcr
時間Tue Jun 17 15:22:52 2008
粘合溫度最高達到73度?? 嘖嘖
我不清楚您primers設計的方式與目的
不過我猜
如果是有要 引入限制媒的切位 請不要計算這幾個鹼基對的Tm
回到正題
一般我做Genomic PCR 只要微調PCR的條件 都可以很順利的有結果
假設: primers 設計時的Tm=60度(切位引入'這時'不要計算)
條件:
95度--5到10分(一般plasmid 頂多3分)
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95度--45s(一般30s)------------|
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60度--45s(一般30s) |----30 cycles
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72度--(依長度)----------------|
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73度--5分
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25度 forever
建議您可以把第一次的PCR 產物照上面,微調成您實際的情況,作一次 2nd PCR
或者
直接重新作一次 Genomic PCR
題外話,我們家學弟妹最常碰到的PCR問題,還是primers 設計
祝您實驗順利
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◆ From: 118.171.5.216
1F：推 A65:請問若是第一步95度太久會怎樣阿? 06/17 17:57
2F：推 yaliu:不是很好 Taq也有所謂的半衰期阿... 我都用94度啦 06/17 20:04
3F：→ sGoat:annealing溫度沒有到達70度是不太需要使用touchdown的 06/20 18:23