作者davideason (Davideason)
看板Biotech
标题Re: [求救] touchdown pcr
时间Tue Jun 17 15:22:52 2008
粘合温度最高达到73度?? 啧啧
我不清楚您primers设计的方式与目的
不过我猜
如果是有要 引入限制媒的切位 请不要计算这几个硷基对的Tm
回到正题
一般我做Genomic PCR 只要微调PCR的条件 都可以很顺利的有结果
假设: primers 设计时的Tm=60度(切位引入'这时'不要计算)
条件:
95度--5到10分(一般plasmid 顶多3分)
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95度--45s(一般30s)------------|
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60度--45s(一般30s) |----30 cycles
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72度--(依长度)----------------|
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73度--5分
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25度 forever
建议您可以把第一次的PCR 产物照上面,微调成您实际的情况,作一次 2nd PCR
或者
直接重新作一次 Genomic PCR
题外话,我们家学弟妹最常碰到的PCR问题,还是primers 设计
祝您实验顺利
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◆ From: 118.171.5.216
1F：推 A65:请问若是第一步95度太久会怎样阿? 06/17 17:57
2F：推 yaliu:不是很好 Taq也有所谓的半衰期阿... 我都用94度啦 06/17 20:04
3F：→ sGoat:annealing温度没有到达70度是不太需要使用touchdown的 06/20 18:23