作者charlielg (chi)
看板Biotech
標題[求救] 有關pcr的問題?
時間Thu Jun 12 18:00:04 2008
最近在做cloning,要把學姊之前clone出來的cDNA(3kb)放入expression vector,
進行蛋白質表現,但我發現cDNA量已不足,自己想amplify這段cDNA,我利用
這段cDNA當作template,而primer則是使用當初夾出這段cDNA的那對primer,
所有反應條件都參考之前學姊的條件,我試了很多次都不成功,結果都沒目標片段,
都是一些分子量約100~500bp的片段.這個問題已困擾很久,希望有心人士能夠給點指引.
感激不盡
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◆ From: 140.121.155.210
1F：→ hajimels:很多次都一樣的條件?還是有不同的ctrl conditions? 06/12 18:27
2F：推 leftt:學姐clone出來的cDNA是塞進哪一個vector? 菌株已經不在了嗎? 06/12 19:02
3F：→ leftt:學姐作出來的只是一個3K PCR fragment嗎 應該會送進vector 06/12 19:04
4F：→ leftt:如果這個plasmid還在 以此為template比較夾的出來 06/12 19:06
5F：→ leftt:如果只有fragment 有時nestPCR會夾不太出來喔 妳可以嘗試 06/12 19:07
6F：→ leftt:用該物種原來的cDNA當模版重新夾一次 3K滿長的 加油 06/12 19:09
7F：推 MrCAKE:我建議先送定序看看序列有沒有問題 06/12 21:26
8F：推 puec2:secondary structure，提高annealing temperature試試。 06/12 21:28
9F：→ puec2:或者拿妳學姊當初P出來的sample再p一次。 06/12 21:29
10F：→ puec2:講錯，是template 06/12 21:29
11F：推 HUVEC:其實我看不懂什麼是clone出來的cDNA .. cDNA是從RNA反轉錄的 06/13 00:25
12F：推 yaliu:想問一下，加入DMSO可以避免secondary structure嗎？ 06/13 00:27
13F：→ yaliu:％數最多可以到多少？ 06/13 00:27
14F：推 yaliu:clone出來的cDNA指的是當初你學姐在吊出這個基因時，一定會 06/13 00:29
15F：→ yaliu:放到一個vector上....那麼之後你就可以利用這個clone直接放 06/13 00:30
16F：→ yaliu:大你的目標基因.... 06/13 00:31