作者charlielg (chi)
看板Biotech
标题[求救] 有关pcr的问题?
时间Thu Jun 12 18:00:04 2008
最近在做cloning,要把学姊之前clone出来的cDNA(3kb)放入expression vector,
进行蛋白质表现,但我发现cDNA量已不足,自己想amplify这段cDNA,我利用
这段cDNA当作template,而primer则是使用当初夹出这段cDNA的那对primer,
所有反应条件都参考之前学姊的条件,我试了很多次都不成功,结果都没目标片段,
都是一些分子量约100~500bp的片段.这个问题已困扰很久,希望有心人士能够给点指引.
感激不尽
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.121.155.210
1F：→ hajimels:很多次都一样的条件?还是有不同的ctrl conditions? 06/12 18:27
2F：推 leftt:学姐clone出来的cDNA是塞进哪一个vector? 菌株已经不在了吗? 06/12 19:02
3F：→ leftt:学姐作出来的只是一个3K PCR fragment吗 应该会送进vector 06/12 19:04
4F：→ leftt:如果这个plasmid还在 以此为template比较夹的出来 06/12 19:06
5F：→ leftt:如果只有fragment 有时nestPCR会夹不太出来喔 你可以尝试 06/12 19:07
6F：→ leftt:用该物种原来的cDNA当模版重新夹一次 3K满长的 加油 06/12 19:09
7F：推 MrCAKE:我建议先送定序看看序列有没有问题 06/12 21:26
8F：推 puec2:secondary structure，提高annealing temperature试试。 06/12 21:28
9F：→ puec2:或者拿你学姊当初P出来的sample再p一次。 06/12 21:29
10F：→ puec2:讲错，是template 06/12 21:29
11F：推 HUVEC:其实我看不懂什麽是clone出来的cDNA .. cDNA是从RNA反转录的 06/13 00:25
12F：推 yaliu:想问一下，加入DMSO可以避免secondary structure吗？ 06/13 00:27
13F：→ yaliu:％数最多可以到多少？ 06/13 00:27
14F：推 yaliu:clone出来的cDNA指的是当初你学姐在吊出这个基因时，一定会 06/13 00:29
15F：→ yaliu:放到一个vector上....那麽之後你就可以利用这个clone直接放 06/13 00:30
16F：→ yaliu:大你的目标基因.... 06/13 00:31