作者owl628 (owl628)
看板Biotech
標題[求救] TA cloning一直失敗.....
時間Wed Jun 4 11:44:12 2008
我用的是invitrogen的TOPO TA Cloning
用Tag P出我的要的片段,約1800b.p
加4ul和1ul的salt solution及1ul的TA vector作用
(22度西 30分鐘)
接著用自己做的competent cell(DH5α)做CaCl2 transformation
結果做了快10盤,不是沒長,就是長的colony抽不出質體
(養的時候感覺菌液就不是很正常,有點稀)
抗生素Ampicillin及Kanamycin都用過了
不知道有沒有人可以給我個建議,麻煩大家了
謝謝~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.139.218
1F：推 yaliu:有確定過抗生素抗性還在後？ 06/04 11:48
2F：→ owl628:有的,抗生素沒有問題,competent cell其他人使用也OK 06/04 11:52
3F：推 alaric:heat shock 後, 有做recover? 06/04 13:04
4F：推 fungihsu:可以看兩個地方 一個是用剛做好的PCR產物 06/04 13:13
5F：→ fungihsu:另一個做transformation大約只加兩ul反應到50ul的細胞裡 06/04 13:14
6F：推 gunyaduck:TA時可以作用久一點 我有時還放O/N @@ 06/04 14:46
7F：推 joveryant:or 16度c o/n 06/04 15:51
8F：→ owl628:heat shock後recover一小時.ligation product一共有6,我拿 06/04 18:50
9F：→ owl628:一半Transform.還有因為vector說明書上說5到30分鐘就夠了, 06/04 18:51
10F：→ owl628:請問有需要到o/n嗎?非commercial的vector我才會o/n,謝謝^^ 06/04 18:52
11F：推 epi:PCR的產物有確認是單一band嗎?純化後的濃度? 06/04 19:47
12F：→ owl628:有跑過膠確定過,濃度沒有測,但是應該滿多的. 06/04 22:13
13F：推 yaliu:會不會kit有壞掉？ 其他人用這個做TA一樣沒問題？ 06/04 22:28
14F：推 intotheman:heat shock 溫度 時間, 處理完要養一小時比較好 06/04 22:55
15F：推 yayarm:你的PCR產物有做gel extraction嘛?有的話可能是這裡有問題 06/05 02:20
16F：→ yayarm:有的gel extraction kit不適合拿來作TA或ligation 06/05 02:22
17F：→ yayarm:可以試著不要纯化PCR產物 直接作TA 不過效率會比較低 06/05 02:23
18F：→ owl628:heat shock時間兩分鐘,42度西.處理完有養一小時 06/05 10:04
19F：→ owl628:我是有做膠回收,會是這裡發生問題嗎???謝謝大家^^ 06/05 10:04
20F：推 maccheng:PCR→PCR clean up→Ligation(RT,1hr或16度C O/N) 06/05 19:47
21F：→ maccheng:→Transformation 06/05 19:47
22F：→ owl628:可以請問做膠回收跟PCR clean up的差異在哪嗎???謝謝大家~ 06/05 22:11
23F：推 yaliu:我也想知道差別？？？ 不過要做下面ligation的步驟 06/05 22:17
24F：→ yaliu:請用水elute 06/05 22:17
25F：→ owl628:我是用水elute沒錯,謝謝~ 06/05 22:19
26F：推 maccheng:個人認為PCR clean up的回收率會比較高 也比較快 06/06 02:21