作者owl628 (owl628)
看板Biotech
标题[求救] TA cloning一直失败.....
时间Wed Jun 4 11:44:12 2008
我用的是invitrogen的TOPO TA Cloning
用Tag P出我的要的片段,约1800b.p
加4ul和1ul的salt solution及1ul的TA vector作用
(22度西 30分钟)
接着用自己做的competent cell(DH5α)做CaCl2 transformation
结果做了快10盘,不是没长,就是长的colony抽不出质体
(养的时候感觉菌液就不是很正常,有点稀)
抗生素Ampicillin及Kanamycin都用过了
不知道有没有人可以给我个建议,麻烦大家了
谢谢~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.128.139.218
1F：推 yaliu:有确定过抗生素抗性还在後？ 06/04 11:48
2F：→ owl628:有的,抗生素没有问题,competent cell其他人使用也OK 06/04 11:52
3F：推 alaric:heat shock 後, 有做recover? 06/04 13:04
4F：推 fungihsu:可以看两个地方 一个是用刚做好的PCR产物 06/04 13:13
5F：→ fungihsu:另一个做transformation大约只加两ul反应到50ul的细胞里 06/04 13:14
6F：推 gunyaduck:TA时可以作用久一点 我有时还放O/N @@ 06/04 14:46
7F：推 joveryant:or 16度c o/n 06/04 15:51
8F：→ owl628:heat shock後recover一小时.ligation product一共有6,我拿 06/04 18:50
9F：→ owl628:一半Transform.还有因为vector说明书上说5到30分钟就够了, 06/04 18:51
10F：→ owl628:请问有需要到o/n吗?非commercial的vector我才会o/n,谢谢^^ 06/04 18:52
11F：推 epi:PCR的产物有确认是单一band吗?纯化後的浓度? 06/04 19:47
12F：→ owl628:有跑过胶确定过,浓度没有测,但是应该满多的. 06/04 22:13
13F：推 yaliu:会不会kit有坏掉？ 其他人用这个做TA一样没问题？ 06/04 22:28
14F：推 intotheman:heat shock 温度 时间, 处理完要养一小时比较好 06/04 22:55
15F：推 yayarm:你的PCR产物有做gel extraction嘛?有的话可能是这里有问题 06/05 02:20
16F：→ yayarm:有的gel extraction kit不适合拿来作TA或ligation 06/05 02:22
17F：→ yayarm:可以试着不要纯化PCR产物 直接作TA 不过效率会比较低 06/05 02:23
18F：→ owl628:heat shock时间两分钟,42度西.处理完有养一小时 06/05 10:04
19F：→ owl628:我是有做胶回收,会是这里发生问题吗???谢谢大家^^ 06/05 10:04
20F：推 maccheng:PCR→PCR clean up→Ligation(RT,1hr或16度C O/N) 06/05 19:47
21F：→ maccheng:→Transformation 06/05 19:47
22F：→ owl628:可以请问做胶回收跟PCR clean up的差异在哪吗???谢谢大家~ 06/05 22:11
23F：推 yaliu:我也想知道差别？？？ 不过要做下面ligation的步骤 06/05 22:17
24F：→ yaliu:请用水elute 06/05 22:17
25F：→ owl628:我是用水elute没错,谢谢~ 06/05 22:19
26F：推 maccheng:个人认为PCR clean up的回收率会比较高 也比较快 06/06 02:21