作者ginkgo0926 (新的里程)
看板Biotech
標題[求救] stable clone挑選
時間Mon Jun 2 00:22:49 2008
第一次製作stable clone 很多地方不清楚
請各位大大不吝賜教!!!
我的基因是放在pEGFP-C1 vector內 使用Daoy cell line
利用invitrogen的Lipofectamine 2000進行transfection
transfection後四天(96hr)換為含有G418(400ug/ml)的medium進行篩選
加入G418經過四天 沒有見到預期的無螢光細胞大量死亡
我的問題是
1.transfection後多久可以加入G418? 濃度為何?
2.G418(100mg/ml)於4度C下可保存多久?
3.加入G418後多久可明顯看到沒有抗藥性的細胞死掉?
4.含有G418的medium需要每天換嗎?
5.我是使用6孔盤進行實驗 若最後僅剩下帶有螢光的細胞
如何將其移出至25T flask培養?
問題有點瑣碎
麻煩各位前輩了
謝謝!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 118.167.168.251
1F：推 nerdz:不同種的cell對g418的抗性有異，可做個ct抓適當的濃度 06/02 00:25
2F：→ nerdz:我們家是-20保存 06/02 00:27
3F：→ nerdz:此外這篩選可能要1到2個禮拜的時間 可能不是4天可以解決的？ 06/02 00:28
4F：推 tsubasawolfy:stable clone 2-4星期 濃度沒參考的話自己試 06/02 01:50
5F：→ tsubasawolfy:另外transfection後大概養24小時候subculture就可以 06/02 01:51
6F：→ tsubasawolfy:加..不過時間一樣看細胞株特性決定 06/02 01:51
7F：→ tsubasawolfy:養滿了就subculture 多的可以丟棄 反正只要有就好 06/02 01:52
8F：→ tsubasawolfy:通常transfection完後的第一個禮拜細胞都還不太會死 06/02 01:53
9F：→ tsubasawolfy:第二個禮拜開始就屍橫遍野<--勤換medium吧Orz 06/02 01:54
10F：推 tsubasawolfy:開始大量死亡之後我就只換medium 讓存活的長成 06/02 01:56
11F：→ tsubasawolfy:single colony..如果這時候subculture不太好.. 06/02 01:57
12F：→ tsubasawolfy:最後會變成多細胞來源..而非單一細胞.. 06/02 01:58
13F：→ ginkgo0926:感謝n大和t大經驗分享~ 06/03 22:33