作者ginkgo0926 (新的里程)
看板Biotech
标题[求救] stable clone挑选
时间Mon Jun 2 00:22:49 2008
第一次制作stable clone 很多地方不清楚
请各位大大不吝赐教!!!
我的基因是放在pEGFP-C1 vector内 使用Daoy cell line
利用invitrogen的Lipofectamine 2000进行transfection
transfection後四天(96hr)换为含有G418(400ug/ml)的medium进行筛选
加入G418经过四天 没有见到预期的无萤光细胞大量死亡
我的问题是
1.transfection後多久可以加入G418? 浓度为何?
2.G418(100mg/ml)於4度C下可保存多久?
3.加入G418後多久可明显看到没有抗药性的细胞死掉?
4.含有G418的medium需要每天换吗?
5.我是使用6孔盘进行实验 若最後仅剩下带有萤光的细胞
如何将其移出至25T flask培养?
问题有点琐碎
麻烦各位前辈了
谢谢!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 118.167.168.251
1F：推 nerdz:不同种的cell对g418的抗性有异，可做个ct抓适当的浓度 06/02 00:25
2F：→ nerdz:我们家是-20保存 06/02 00:27
3F：→ nerdz:此外这筛选可能要1到2个礼拜的时间 可能不是4天可以解决的？ 06/02 00:28
4F：推 tsubasawolfy:stable clone 2-4星期 浓度没参考的话自己试 06/02 01:50
5F：→ tsubasawolfy:另外transfection後大概养24小时候subculture就可以 06/02 01:51
6F：→ tsubasawolfy:加..不过时间一样看细胞株特性决定 06/02 01:51
7F：→ tsubasawolfy:养满了就subculture 多的可以丢弃 反正只要有就好 06/02 01:52
8F：→ tsubasawolfy:通常transfection完後的第一个礼拜细胞都还不太会死 06/02 01:53
9F：→ tsubasawolfy:第二个礼拜开始就屍横遍野<--勤换medium吧Orz 06/02 01:54
10F：推 tsubasawolfy:开始大量死亡之後我就只换medium 让存活的长成 06/02 01:56
11F：→ tsubasawolfy:single colony..如果这时候subculture不太好.. 06/02 01:57
12F：→ tsubasawolfy:最後会变成多细胞来源..而非单一细胞.. 06/02 01:58
13F：→ ginkgo0926:感谢n大和t大经验分享~ 06/03 22:33