作者yukilee (yuki)
看板Biotech
標題[求救] 又是PCR!兇手是primer嗎?
時間Fri May 30 11:58:43 2008
小的幾乎每天都要PCR 手上也很多組primer都要P
可是目前就是有2組primer最討厭了~很奇怪~
狀況就是: negative ctrl 一直有band!!(污染???)
請廠商合成的primer, dilute成10X後的冰-20C
剛開始dilute成1X的冰4C, 現在也改冰-20C
可是都是廠商送來後使用第一次dilute的primer P出來都OK
neg ctrl空空如也! perfect!!
可是到了要P第二次/第三次時 neg ctrl就出現band了!
重新從10X dilute的也一樣(有時候又OK~~)
重新請廠商合成的狀況也一樣:
收到primer --> dilute 10X [in Hood(嚴重到連dilute都在hood裡進行了!),
分裝成很多小管, 冰-20C] --> dilute 1X --> PCR OK!(neg ctrl 沒有出現)
隔天, 重複使用1X的繼續P第二批 --> 有時候OK, 有時候不OK!!
第三批 --> 肯定不OK!!
重新從10X再dilute 1X, 幸運的話, 第一次OK, 第二次OK/不OK, 第三次不OK
不幸運的話, 連第一次也都不OK!
剛開始1X我都會dilute成100ul, 現在已經減少到50ul...
已經試過了很多遍了, 也絕對不是buf, dNTP, H2O的問題...
因為有試過用同樣的buf, dNTP, H2O, 別組primer都很正常!
pipet照UV, tip, epp都是用剛滅菌沒開過的!
就只有特定的那2組primer才會有這樣的狀況!
請問有沒有高手知道問題在哪裡??
primer設計不良??穩定性不夠?? (會造成neg ctrl出現band??)
廠商的問題??合成不夠純?? (重新合成也一樣??別組primer同廠商也沒問題)
甚至請別家廠商合成同一組primer狀況也一樣!
兇手就是primer本身了吧???
可是primer我是照paper提供的阿~?!
有沒有人可以幫我看一下primer本身有沒有問題啊??
primer A
5': 5'-ACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAG-3'
3': 5'-CTCGCGGATGGCGCTGAGGCC-3'
primer B
5': 5'-CTCGGGTGTTCCGGCAAACTG-3'
3': 5'-CGCAGAGGAAGCTGGAGAAAG-3'
救救我吧!我真的快被搞瘋了!!
先叩謝了!!! Orz
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◆ From: 163.15.154.12
※ 編輯: yukilee 來自: 163.15.154.12 (05/30 12:11)
1F：推 shunze:戴手套做實驗看看 05/30 12:18
2F：→ yukilee:我都有戴啊~@@" 05/30 12:22
3F：→ yukilee:狂噴酒精,戴口罩,關冷氣,在hood裡配都試過了!一樣! 05/30 12:24
4F：推 belady:電風扇不要開 不要說話 確定所有東西都有滅菌完全嗎？ 05/30 12:55
5F：→ belady:BAND的大小 還是其實是primer dimmer? 05/30 12:56
6F：→ yukilee:就跟target band一樣大,時淡時亮,跑過快要跳海了還是存在! 05/30 13:34
※ 編輯: yukilee 來自: 163.15.154.12 (05/30 13:35)
7F：推 hchs890843:借別人家實驗室配一次PCR看看...連水都跟他們要 05/30 13:51
8F：→ hchs890843:曾經有聽過水被某東西汙染把PCR搞得人仰馬翻的事 05/30 13:52
9F：推 nerdz:好p的sample就沒有那條band？反之則會明顯出現？ 05/30 14:59
10F：推 meiosisLin:pipetman.....可能有污染........ 05/30 16:19
11F：→ yukilee:有試過固定同一個sample P, pipet都有照UV overnight 05/30 16:29
12F：→ yukilee:試過同樣的水同樣的pipet,不同的primer是OK的! 05/30 16:33
13F：推 hchs890843:不同的primer當然可能會夾不到東西... 05/30 19:27
14F：→ hchs890843:一定要....換水換實驗室換工具!!!!! 05/30 19:28
15F：推 nixo:用別的pipette試試看，或是用有濾膜的tip。 05/30 21:40
16F：推 yaliu:要不要....換個人換個實驗室P看看？ 05/30 22:34
17F：推 dankai:primer本身或許就已經污染了~ 05/30 22:50
18F：推 david31408:我P不同的primer都會換手套耶 05/30 23:33
19F：推 freesoul:最大的可能就是水，不同primer當然不一定會有產物 05/31 04:34
20F：推 ookubo:不放template，primer...等，下去跑跑看，一樣一樣抓.... 05/31 06:09
21F：→ ookubo:以前被這樣搞過，轉基因的assay negative都是band...... 05/31 06:10
22F：→ ookubo:後來抓到是廠商送來的dNTP原液污染....一整個無言.....@@ 05/31 06:11
23F：→ yukilee:回以上部分:我的template是病人血液的DNA,每個病人都要 05/31 10:36
24F：→ yukilee:不同的primer然後再分析SNP,所以換primer P是一定會有產物 05/31 10:38
25F：→ yukilee:的,我上面的OK不OK是指neg ctrl有沒有band,沒有band是OK 05/31 10:40
26F：→ yukilee:不知道我的表達方式大家有沒有看懂~@@~ 05/31 10:40
27F：→ yukilee:我也都有換pipet換bench還跑到hood裡做過了~~><~~ 05/31 10:43
28F：→ yukilee:回O大:我有試過neg不加primer,結果當然是沒有band,所以應 05/31 10:47
29F：→ yukilee:該其他東西buf,dNTP等都是正常的吧??!! 05/31 10:48
30F：推 david31408:產物多大? 05/31 15:04
31F：→ yukilee:primerA 265bp, primerB 72bp 05/31 16:00
32F：推 david31408:你的NC會部會只是dimer? 06/01 01:25
33F：→ yukilee:6F回答過了...... 06/01 08:45
34F：推 maccheng:polymerase contamination? 我們lab有遇過^^" 06/04 01:05