作者yukilee (yuki)
看板Biotech
标题[求救] 又是PCR!凶手是primer吗?
时间Fri May 30 11:58:43 2008
小的几乎每天都要PCR 手上也很多组primer都要P
可是目前就是有2组primer最讨厌了~很奇怪~
状况就是: negative ctrl 一直有band!!(污染???)
请厂商合成的primer, dilute成10X後的冰-20C
刚开始dilute成1X的冰4C, 现在也改冰-20C
可是都是厂商送来後使用第一次dilute的primer P出来都OK
neg ctrl空空如也! perfect!!
可是到了要P第二次/第三次时 neg ctrl就出现band了!
重新从10X dilute的也一样(有时候又OK~~)
重新请厂商合成的状况也一样:
收到primer --> dilute 10X [in Hood(严重到连dilute都在hood里进行了!),
分装成很多小管, 冰-20C] --> dilute 1X --> PCR OK!(neg ctrl 没有出现)
隔天, 重复使用1X的继续P第二批 --> 有时候OK, 有时候不OK!!
第三批 --> 肯定不OK!!
重新从10X再dilute 1X, 幸运的话, 第一次OK, 第二次OK/不OK, 第三次不OK
不幸运的话, 连第一次也都不OK!
刚开始1X我都会dilute成100ul, 现在已经减少到50ul...
已经试过了很多遍了, 也绝对不是buf, dNTP, H2O的问题...
因为有试过用同样的buf, dNTP, H2O, 别组primer都很正常!
pipet照UV, tip, epp都是用刚灭菌没开过的!
就只有特定的那2组primer才会有这样的状况!
请问有没有高手知道问题在哪里??
primer设计不良??稳定性不够?? (会造成neg ctrl出现band??)
厂商的问题??合成不够纯?? (重新合成也一样??别组primer同厂商也没问题)
甚至请别家厂商合成同一组primer状况也一样!
凶手就是primer本身了吧???
可是primer我是照paper提供的阿~?!
有没有人可以帮我看一下primer本身有没有问题啊??
primer A
5': 5'-ACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAG-3'
3': 5'-CTCGCGGATGGCGCTGAGGCC-3'
primer B
5': 5'-CTCGGGTGTTCCGGCAAACTG-3'
3': 5'-CGCAGAGGAAGCTGGAGAAAG-3'
救救我吧!我真的快被搞疯了!!
先叩谢了!!! Orz
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.154.12
※ 编辑: yukilee 来自: 163.15.154.12 (05/30 12:11)
1F：推 shunze:戴手套做实验看看 05/30 12:18
2F：→ yukilee:我都有戴啊~@@" 05/30 12:22
3F：→ yukilee:狂喷酒精,戴口罩,关冷气,在hood里配都试过了!一样! 05/30 12:24
4F：推 belady:电风扇不要开 不要说话 确定所有东西都有灭菌完全吗？ 05/30 12:55
5F：→ belady:BAND的大小 还是其实是primer dimmer? 05/30 12:56
6F：→ yukilee:就跟target band一样大,时淡时亮,跑过快要跳海了还是存在! 05/30 13:34
※ 编辑: yukilee 来自: 163.15.154.12 (05/30 13:35)
7F：推 hchs890843:借别人家实验室配一次PCR看看...连水都跟他们要 05/30 13:51
8F：→ hchs890843:曾经有听过水被某东西污染把PCR搞得人仰马翻的事 05/30 13:52
9F：推 nerdz:好p的sample就没有那条band？反之则会明显出现？ 05/30 14:59
10F：推 meiosisLin:pipetman.....可能有污染........ 05/30 16:19
11F：→ yukilee:有试过固定同一个sample P, pipet都有照UV overnight 05/30 16:29
12F：→ yukilee:试过同样的水同样的pipet,不同的primer是OK的! 05/30 16:33
13F：推 hchs890843:不同的primer当然可能会夹不到东西... 05/30 19:27
14F：→ hchs890843:一定要....换水换实验室换工具!!!!! 05/30 19:28
15F：推 nixo:用别的pipette试试看，或是用有滤膜的tip。 05/30 21:40
16F：推 yaliu:要不要....换个人换个实验室P看看？ 05/30 22:34
17F：推 dankai:primer本身或许就已经污染了~ 05/30 22:50
18F：推 david31408:我P不同的primer都会换手套耶 05/30 23:33
19F：推 freesoul:最大的可能就是水，不同primer当然不一定会有产物 05/31 04:34
20F：推 ookubo:不放template，primer...等，下去跑跑看，一样一样抓.... 05/31 06:09
21F：→ ookubo:以前被这样搞过，转基因的assay negative都是band...... 05/31 06:10
22F：→ ookubo:後来抓到是厂商送来的dNTP原液污染....一整个无言.....@@ 05/31 06:11
23F：→ yukilee:回以上部分:我的template是病人血液的DNA,每个病人都要 05/31 10:36
24F：→ yukilee:不同的primer然後再分析SNP,所以换primer P是一定会有产物 05/31 10:38
25F：→ yukilee:的,我上面的OK不OK是指neg ctrl有没有band,没有band是OK 05/31 10:40
26F：→ yukilee:不知道我的表达方式大家有没有看懂~@@~ 05/31 10:40
27F：→ yukilee:我也都有换pipet换bench还跑到hood里做过了~~><~~ 05/31 10:43
28F：→ yukilee:回O大:我有试过neg不加primer,结果当然是没有band,所以应 05/31 10:47
29F：→ yukilee:该其他东西buf,dNTP等都是正常的吧??!! 05/31 10:48
30F：推 david31408:产物多大? 05/31 15:04
31F：→ yukilee:primerA 265bp, primerB 72bp 05/31 16:00
32F：推 david31408:你的NC会部会只是dimer? 06/01 01:25
33F：→ yukilee:6F回答过了...... 06/01 08:45
34F：推 maccheng:polymerase contamination? 我们lab有遇过^^" 06/04 01:05