作者nk12914 (尋找)
站內Biotech
標題[求救] 這樣的結果還能繼續往下做嗎??
時間Thu May 29 00:11:04 2008
前不久有PO版
也有一些網友給了我建議 像是check產的protein有沒有毒性
但沒有paper有提到 而且其實這個protein先前就有paper induction成功
只是我的實驗 選用的vector不同 但都是pET系列的
可是怎麼做都遇到問題
問題如下:
實驗try了三種菌去做induction BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE
SDS-PAGE始終都無法看出明顯很粗induction的BAND
甚至連空的菌(沒有transform的)都在差不多的位置有看到BAND
根本無法看出空的菌、沒有induction、跟有induction的差異(因為在那位置上 都有BAND)
後來壓WB 空的就沒有BAND 而沒有induction跟有induction都有明顯的band
但兩者看不出差異 好像根本就是不用加IPTG 就可以跟有加IPTG的結果一樣
圖檔如下 預期的size為47 kDa
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=shuo218&b=3&f=1786188116&p=0
C:control 空的菌(沒有送入plasmid)
N-1、N-2:沒有induction
其餘為不同濃度的IPTG(0.5mM、1mM、2mM) 37度C 三小時
上面的結果必須要WB的情況才看的到 SDS-PAGE無法區別(因為連空的都有BAND)
那可以繼續往下做purify嗎?
還是應該在修正其他condition嗎?
因為已經做到鬼打牆的地步 想尋求大家的幫忙
大家覺得可以繼續往下做嗎?
之後purify的protein會用來打兔子產Ab 還有treat 細胞
已經卡在induction很久一段時間了 再沒結果大概就要換題目了
可是又不想放掉 想請大家幫幫忙 是否有什麼地方應該修正的
小弟在此先深深地鞠躬感激 謝謝了!!!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.77.129
1F：→ aggaci:protein是soluble form就有做的價值！ 05/29 00:29
2F：→ aggaci:不是inclusion body就該謝天謝地了 05/29 00:29
3F：推 aggaci:量少大不了養多一點 05/29 00:32
4F：推 liuse:量很少耶 就算養幾百c.c來純化也purity也不會高 05/29 00:42
5F：→ liuse:這樣打兔子出來抗體也不一定能用喔 05/29 00:42
6F：推 serv:你沒有純化耶 有純化的話濃度會高很多才對 05/29 03:15
7F：推 Ren:我覺得有東西…所以是我的話會純化看看有多少 05/29 07:09
8F：→ Ren:有時候PAGE是不太好用的，always case by case 05/29 07:10
9F：推 wanyi:我覺得溫度可以降到室溫overnight做做看~對有些protein有效 05/29 09:47
10F：推 Ren:我的SDS-PAGE狀況還比你糟，可是產率也還有10~ 25 mg. 05/29 13:49
11F：→ Ren:以上per liter. So, because you have tried, why not purify 05/29 13:50
12F：→ nk12914:謝謝大家給我的建議 我會往下試試看的 謝謝!! 05/30 11:15