最近也一直在iPCR裡摸索@@ 不過我可以提供我的經驗給你 因為我曾經很幸運的成功了一次 雖然另一個像鬼打牆一樣只出來給我看過一次弱弱的band後就在也不出來了Q_Q ※ 引述《pocheng0227 ()》之銘言： : 我最近在做inverse PCR, 想嘗試用這個方式將一個gene的未知序列p出來 : gene的大小約2.4kb, 中間1.2kb的序列已知, 之前是用degenerate primer p出來的. : 已經連續p兩個禮拜了, 調整過不同的PCR condition, 結果都完全沒有band : 想請教板上的各位, 可能是哪裡出問題了? : 以下是我的protocol: : 1. 3ug genomic DNA digestion (50ml reaction), 37度C, O/N : 2. Heat inactivate之後, 直接取出3.5ul or 7ul (約0.2ug/0.4ug DNA)來進行ligation, : ligase濃度400U, in a 100 ml reaction. 15度C, O/N 基本上我有先做南方雜和，看看目標基因位置落在哪裡，切膠純化（至少縮小了範圍） 當然我會再PCR一次check我要的基因有沒有被我純化出來 如果你不想切膠純化的話，至少digest後的DNA要先純化才去做ligation 一般我做ligation體積不會用那麼大 我都做10ul，頂多最高到20ul(我想說體積太大或許不好碰撞吧，我是這麼覺得的啦) : 3. 用PCR extraction kit將ligated DNA純化 我沒純化就直接去P了 : 4. PCR reaction: : denaturing 94C 1 min : annealing 50~58C 1 min : extention 72C 3~10min : DNA的量大約40~80ng, : annealing temp.我試了50,55,58C : extention time試了3, 5, 10min : 跑出來都完全沒東西@@" 另外，我想問的是 你選用的限制酵素應該有注意到 在你已經放大出的片段裡面找不到他吧！？ 我建議還是要做一下南方 看看你切完後含目標基因的DNA片段到底有多大 會比較好控制你PCR條件 --

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