最近也一直在iPCR里摸索@@ 不过我可以提供我的经验给你 因为我曾经很幸运的成功了一次 虽然另一个像鬼打墙一样只出来给我看过一次弱弱的band後就在也不出来了Q_Q ※ 引述《pocheng0227 ()》之铭言： : 我最近在做inverse PCR, 想尝试用这个方式将一个gene的未知序列p出来 : gene的大小约2.4kb, 中间1.2kb的序列已知, 之前是用degenerate primer p出来的. : 已经连续p两个礼拜了, 调整过不同的PCR condition, 结果都完全没有band : 想请教板上的各位, 可能是哪里出问题了? : 以下是我的protocol: : 1. 3ug genomic DNA digestion (50ml reaction), 37度C, O/N : 2. Heat inactivate之後, 直接取出3.5ul or 7ul (约0.2ug/0.4ug DNA)来进行ligation, : ligase浓度400U, in a 100 ml reaction. 15度C, O/N 基本上我有先做南方杂和，看看目标基因位置落在哪里，切胶纯化（至少缩小了范围） 当然我会再PCR一次check我要的基因有没有被我纯化出来 如果你不想切胶纯化的话，至少digest後的DNA要先纯化才去做ligation 一般我做ligation体积不会用那麽大 我都做10ul，顶多最高到20ul(我想说体积太大或许不好碰撞吧，我是这麽觉得的啦) : 3. 用PCR extraction kit将ligated DNA纯化 我没纯化就直接去P了 : 4. PCR reaction: : denaturing 94C 1 min : annealing 50~58C 1 min : extention 72C 3~10min : DNA的量大约40~80ng, : annealing temp.我试了50,55,58C : extention time试了3, 5, 10min : 跑出来都完全没东西@@" 另外，我想问的是 你选用的限制酵素应该有注意到 在你已经放大出的片段里面找不到他吧！？ 我建议还是要做一下南方 看看你切完後含目标基因的DNA片段到底有多大 会比较好控制你PCR条件 --

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