※ 引述《seal0413 (seal)》之銘言： : 請問酒精固定的細胞可以做annexin v和PI的雙染法嗎?????????? : 若有人可提供此實驗的protocol 更是感激不盡 剛看完Macross Frontier 6心情好v(￣︶￣)y 1. 前置細胞數 (條件可以自己抓) 10cm dish 10^5~10^6 6-well 2*10^5 per well 2. <<<<<你的實驗處理>>>>>> Positive control一定要有 而且要一定會出現apoptosis的濃度...死成一片最好 3. Harvest cell with trypsin (如果連已死亡漂浮的細胞也要看的話記得把wash的PBS也加進去離心) 4. Centrifuge 2000rpm at 4 centigrade for 5 min, remove supernant 5. PBS wash and draw out PBS 6. Rnise with 1X Binding buffer(250uL) 7. Centrifuge 2000rpm at 4 centigrade for 5 min, remove supernant 8. Resuspen with 200uL 1X Binding buffer ====重要步驟===== 把 Control 分成兩管 一管雙染 一管都不染 把 positive control分成三管 一管雙染 一管單染AV一管單染PI 分管理由-矯正機器(上機後的事)(Beckman機器 BD不清楚是否需要調校) 雙染Control調整到左下區域後 再分別換成單染AV看是否有落在正確象限 再換成單染PI看有沒有落在正確象限 再換成positive control的雙染看是否落在正確象限 最後換成不染的Control看剛剛調整的是否有跑掉 ================ 9. Add 5uL Annexin V(20ug/mL), 10uL PI(50ug/mL) (BD kit) 10.Incubation in dark for 15 min. 11.Add 1X binding buffer to 1000uL. 12.立刻上機 (所以第九步通常拿到機器那邊再操作) 心得:跑AV-PI最難的地方在調整..... -- EVA-RETAKE══════════╬SPHRYU ASUKA LANGLEY ◣ thePainter Wenn "Liebe" heißt,dieses Versprechen bis zum Tode ▎◥ ◥ ◣ nicht zu brechen...dann verspreche ich: ◣ ▍ ▁▃▄▅▄▃◥ dich immer zu lieben,und keinen Mann außer dir, ◥◥ ▌ ▇▌ ◥▆▅◢◥ solange ich lebe.Alles an mir...von Kopf bis Fuß, ◥▋ ▋"▅ ▁ sogar jedes Haar auf meinem Kopf gehört dir. ◥ ‵▆▆▇ --

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