※ 引述《seal0413 (seal)》之铭言： : 请问酒精固定的细胞可以做annexin v和PI的双染法吗?????????? : 若有人可提供此实验的protocol 更是感激不尽 刚看完Macross Frontier 6心情好v(￣︶￣)y 1. 前置细胞数 (条件可以自己抓) 10cm dish 10^5~10^6 6-well 2*10^5 per well 2. <<<<<你的实验处理>>>>>> Positive control一定要有 而且要一定会出现apoptosis的浓度...死成一片最好 3. Harvest cell with trypsin (如果连已死亡漂浮的细胞也要看的话记得把wash的PBS也加进去离心) 4. Centrifuge 2000rpm at 4 centigrade for 5 min, remove supernant 5. PBS wash and draw out PBS 6. Rnise with 1X Binding buffer(250uL) 7. Centrifuge 2000rpm at 4 centigrade for 5 min, remove supernant 8. Resuspen with 200uL 1X Binding buffer ====重要步骤===== 把 Control 分成两管 一管双染 一管都不染 把 positive control分成三管 一管双染 一管单染AV一管单染PI 分管理由-矫正机器(上机後的事)(Beckman机器 BD不清楚是否需要调校) 双染Control调整到左下区域後 再分别换成单染AV看是否有落在正确象限 再换成单染PI看有没有落在正确象限 再换成positive control的双染看是否落在正确象限 最後换成不染的Control看刚刚调整的是否有跑掉 ================ 9. Add 5uL Annexin V(20ug/mL), 10uL PI(50ug/mL) (BD kit) 10.Incubation in dark for 15 min. 11.Add 1X binding buffer to 1000uL. 12.立刻上机 (所以第九步通常拿到机器那边再操作) 心得:跑AV-PI最难的地方在调整..... -- EVA-RETAKE══════════╬SPHRYU ASUKA LANGLEY ◣ thePainter Wenn "Liebe" heißt,dieses Versprechen bis zum Tode ▎◥ ◥ ◣ nicht zu brechen...dann verspreche ich: ◣ ▍ ▁▃▄▅▄▃◥ dich immer zu lieben,und keinen Mann außer dir, ◥◥ ▌ ▇▌ ◥▆▅◢◥ solange ich lebe.Alles an mir...von Kopf bis Fuß, ◥▋ ▋"▅ ▁ sogar jedes Haar auf meinem Kopf gehört dir. ◥ ‵▆▆▇ --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 163.15.174.166