作者crazyrange (熱血羽球)
看板Biotech
標題[求救] DNA/RNA定量原理?
時間Fri Apr 25 16:42:52 2008
為了計算這個東西我查了一下網路
O.D = 濃度 x 消光係數(即DNA 20 ul/ug; RNA 25ul/ug)
換算回來就是 濃度= O.D x factor(即DNA 50 ng/ul;RNA 40 ng/ul)
以純的DNA來說 用50 ng/ul純DNA可以測到A260為1.0
以純的RNA來說 用40 ng/ul純RNA可以測到A260為1.0
我的問題出現了
因為RNA/DNA都是用A260測
那麼以純的DNA測DNA A260可以得到1.0
那麼以純的DNA測RNA A260的話同樣也可以得到1.0
(因為她們都是用A260去測的)
可是明明就沒有RNA 可是按照公式換算
1.0 x 40 ng/ul 還是可以計算的出RNA
這樣不就變的很奇怪
一般我們萃取的RNA裡面多少都會含有DNA
在那非純的情況下(有RNA和DNA)
那麼A260所測得的吸光值是
濃度(DNA)x消光係數+濃度(RNA)x消光係數?
此外
吸光值是藉由鹼基會吸收紫外光來測量
萃取RNA後為了排除DNA的汙染
會使用DNase來破壞DNA成為oligo- or mono-nucleotide
可是在測量吸光值的時候necleotide還在
一樣會被納入吸光值裡面
這樣測起來濃度不就超不準
後我來想想DNase的目的只是避免RT的時候DNA也會被RT到
所以DNase只能解決這個問題,但濃度的問題還是在?
怎麼會這樣?
因為我是自己查資料來學這部份的
可能很多人會是學長姐教導的
所以在學的時候,可能就不會去想這問題自然就接受了
可能是我比較刁鑽吧.
不過,我想這應該算是個問題吧
煩請各位有經驗的大大解解疑惑
感恩!感恩!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 59.120.7.114
1F：推 dankai:所以有時候我們還是會再電泳一下做確認 04/25 17:00
2F：推 sima:應該是說NanoDrop裡面測DNA或RNA的選項 其實只是幫你回推那個 04/26 00:00
3F：→ sima:factor的不一樣而已 這樣分不出裡面究竟有多少的RNA或DNA 04/26 00:00
4F：→ sima:若要真的分開 或許可以用一些有選別性的螢光來定量 04/26 00:01
5F：→ sima:Invitrogen有出這樣的kit 但是其實也不能完全分開就是了 囧~ 04/26 00:01
6F：推 freesoul:freesoul所以重點是抽的時候要乾淨，抽完記得跑電泳 04/26 00:18