作者gwendiline (丹丹)
看板Biotech
標題[求救] semi-quantitative PCR的問題><
時間Fri Mar 28 00:08:54 2008
在跑RT-PCR之前
我有將兩個樣品的cDNA
都以分光光度計定量到O.D = 1
我不確定這樣做對不對
但 畢竟要比較兩個樣品基因表現量
template量也要一樣多
所以我唯一想到快又方便的方法 就是這樣定量了
結果跑出來
actin (housekeeping gene)
A樣品產物超多
B樣品還好
而target基因
A樣品有表現
B樣品則完全無條帶
如此結果 應該說明template量不同所造成差異..
想請問大家
接下來我該如何做?
看樣子分光光度計似乎無法定量
或是 我應該看A樣品actin的亮度
慢慢加B樣品cDNA的量?
實驗室還沒有人做過semi quantitative PCR
所以 我只能來版上請教大家了
先謝謝回覆~^^
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◆ From: 140.120.192.30
1F：推 aggaci:這很難做ㄝ！怎不用QPCR哩？ 03/28 00:30
2F：推 soom:semi-quant應該要做cDNA的序列稀釋或是不同cycle數吧 03/28 13:59
3F：推 imxxl:請老師讓你們做Q PCR吧... 03/28 14:48
4F：推 lanth:沒辦法做Q的話試試看Competitive RT-PCR 03/28 16:56
5F：推 shonshonGie:我們是以分光光度計測量RNA濃度 換算之後每管以3ug的 03/28 22:38
6F：→ shonshonGie:RNA下去轉cDNA 跑PCR時 只要template加入體積一樣 03/28 22:40
7F：→ shonshonGie:GAPDH就差不多一樣亮囉! 03/28 22:41
8F：→ shonshonGie:by the way 我覺得actin不是很適合做RNA的 03/28 22:42
9F：→ shonshonGie:internal control 因為大部分時候細胞骨架 03/28 22:42
10F：→ shonshonGie:表現量不會改變太大 所以actin RNA不易測到 03/28 22:43
11F：推 aggaci:只要template加入體積一樣=>GAPDH就差不多一樣亮?? 03/29 14:06
12F：→ aggaci:細胞骨架表現量不會改變太大=>actin不是很適合做RNA的 03/29 14:06
13F：推 aggaci:internal control? 03/29 14:12
14F：→ gwendiline:先感謝各位意見 目前 我已經全轉cDNA了 沒有RNA可以定 03/29 16:15
15F：→ gwendiline:量>< 目前 Actin是十倍亮度 template加十倍 可以嗎 03/29 16:16
16F：→ gwendiline:還有 我不懂 為何actin不適合呢? 03/29 16:17
17F：→ gwendiline:最後...就是因為沒有設備 才會這樣作呀..T T 03/29 16:21
18F：推 aggaci:actin在大部分情況下很適合 03/29 20:43
19F：推 momyourb:我學長都用ACTIN做，他跑得都不錯啊 03/29 21:16
20F：→ gwendiline:另外想請問 定量RNA與定量cDNA有何差異嗎? 03/30 00:55
21F：推 zoom8080:RNA比較能反應真實表現 cDNA變數太多 一般人比較不相信 03/30 13:07
22F：推 zoom8080:但Northern比較不靈敏 RNA太少時不能做 才有Q-PCR 03/30 13:11
23F：推 lanth:必須先確定actin的表現量在實驗組及對照組上相同 04/01 08:30
24F：→ lanth:為了省麻煩通常直接參考paper 04/01 08:31