作者gwendiline (丹丹)
看板Biotech
标题[求救] semi-quantitative PCR的问题><
时间Fri Mar 28 00:08:54 2008
在跑RT-PCR之前
我有将两个样品的cDNA
都以分光光度计定量到O.D = 1
我不确定这样做对不对
但 毕竟要比较两个样品基因表现量
template量也要一样多
所以我唯一想到快又方便的方法 就是这样定量了
结果跑出来
actin (housekeeping gene)
A样品产物超多
B样品还好
而target基因
A样品有表现
B样品则完全无条带
如此结果 应该说明template量不同所造成差异..
想请问大家
接下来我该如何做?
看样子分光光度计似乎无法定量
或是 我应该看A样品actin的亮度
慢慢加B样品cDNA的量?
实验室还没有人做过semi quantitative PCR
所以 我只能来版上请教大家了
先谢谢回覆~^^
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◆ From: 140.120.192.30
1F：推 aggaci:这很难做ㄝ！怎不用QPCR哩？ 03/28 00:30
2F：推 soom:semi-quant应该要做cDNA的序列稀释或是不同cycle数吧 03/28 13:59
3F：推 imxxl:请老师让你们做Q PCR吧... 03/28 14:48
4F：推 lanth:没办法做Q的话试试看Competitive RT-PCR 03/28 16:56
5F：推 shonshonGie:我们是以分光光度计测量RNA浓度 换算之後每管以3ug的 03/28 22:38
6F：→ shonshonGie:RNA下去转cDNA 跑PCR时 只要template加入体积一样 03/28 22:40
7F：→ shonshonGie:GAPDH就差不多一样亮罗! 03/28 22:41
8F：→ shonshonGie:by the way 我觉得actin不是很适合做RNA的 03/28 22:42
9F：→ shonshonGie:internal control 因为大部分时候细胞骨架 03/28 22:42
10F：→ shonshonGie:表现量不会改变太大 所以actin RNA不易测到 03/28 22:43
11F：推 aggaci:只要template加入体积一样=>GAPDH就差不多一样亮?? 03/29 14:06
12F：→ aggaci:细胞骨架表现量不会改变太大=>actin不是很适合做RNA的 03/29 14:06
13F：推 aggaci:internal control? 03/29 14:12
14F：→ gwendiline:先感谢各位意见 目前 我已经全转cDNA了 没有RNA可以定 03/29 16:15
15F：→ gwendiline:量>< 目前 Actin是十倍亮度 template加十倍 可以吗 03/29 16:16
16F：→ gwendiline:还有 我不懂 为何actin不适合呢? 03/29 16:17
17F：→ gwendiline:最後...就是因为没有设备 才会这样作呀..T T 03/29 16:21
18F：推 aggaci:actin在大部分情况下很适合 03/29 20:43
19F：推 momyourb:我学长都用ACTIN做，他跑得都不错啊 03/29 21:16
20F：→ gwendiline:另外想请问 定量RNA与定量cDNA有何差异吗? 03/30 00:55
21F：推 zoom8080:RNA比较能反应真实表现 cDNA变数太多 一般人比较不相信 03/30 13:07
22F：推 zoom8080:但Northern比较不灵敏 RNA太少时不能做 才有Q-PCR 03/30 13:11
23F：推 lanth:必须先确定actin的表现量在实验组及对照组上相同 04/01 08:30
24F：→ lanth:为了省麻烦通常直接参考paper 04/01 08:31