: 1.就我個人經驗，PCR product做TA cloning時， : 這樣的ligation成功機率非常高， : 非常容易得到多且正確的colonies。 : 但其他的steaky end ligation很少有如此高的成功率。 : 所以你後來得到的colony數目不多實屬正常現象。 : 不過我也不知道為什麼TA ligation的效率會比 : 其他steaky end ligation來得高， : 有沒有高手解答一下？ 我認為TA效率高的原因可能是因為 TA ligation 只需T與A一個mer之間的碰撞即可，且TA又是雙氫鍵，鍵能亦比CG低 反觀像是RE digestion的steaky end多為四個mer 所以就機率與鍵量來說ligation效率應該會比較高 : 2.請問原po有沒有注意vector和insert之間的比例？ : 一般來說， : insert的量必須遠高過vector， : 效率才會好。 : 不過重點是， : 其實只長一顆也沒關係呀， : 有中就好!! : 3.檢驗pEGFP-N1有無被切開， : 可以跑膠比較切以前和切以後的plasmid大小， : 雖然被切下的部分只有40-50bp應該看不到， : 但是如果環形的plasmid有被切成線形， : 跑膠後大小會和原本的環形差很多。 : 4.不知道你有沒有做vector only和insert only的control? ※ 編輯: countonme 來自: 140.114.100.189 (03/26 18:05)