※ [本文轉錄自 Bioindustry 看板] 作者: frela (漫步北台灣) 看板: Bioindustry 標題: Re: [問題] 關於real-time PCR的問題 時間: Tue Mar 25 23:10:33 2008 您好,我是某公司的產品專員, 根據敝公司的SYBR Green supermix KIT標準操作手冊中指出, primer的終濃度一般最好是介於100~500 nM 左右 而您文中之意是貴老師認為最好終濃度在500 nM 而您"不小心"只用了終濃度50 nM 基本上,若不考慮不同產品的優劣性... 您用的量,"會不會太少?" 這個問題...我想很少人可以回答,因為不同的檢體或樣本 都有可能有其最佳的條件存在,primer也是一個需要考量的條件, (比如說primer 的濃度低,是可以有效降低primer dimer的問題... 不過這是不得已的解決辦法...) 關鍵在於一般像QPCR這種相當敏感的實驗來說.. 您的positive control及negative control能不能有效證明您的實驗是合理的, 才是重點! 如果之前沒有設定的話 您就重新各設定一個positive control及negative control來證明... 若依我不負責任的說法...我倒覺得根本沒差多少,只是最低濃度的二分之一? 論文中明確著明方法即可... ※ 引述《candy315 (沉澱)》之銘言： : 各位大大好，我是某大學的碩士生 : 我想請教關於real-time PCR的問題 : 大部份的實驗...都會用RNA轉cDNA然後再做real-time PCR : 但我的template是genomic DNA : 也有聽說genomic DNA的real-time比較不好做.. : 然後，一個大問題來了 : 我們老闆說，primer的量通常是總體積的1/10左右 : 所以我先用一般PCR在測試primer時，我是用5uM的primer，然後每管取2.5ul : (total volumn為25ul) : 但做real-time時，因為我陰錯陽差的失誤 : 一直以來，我都是用5um的primer，然後每管加0.25ul : (total volumn亦為25ul) : 我想請問大家，有人用過這麼少量的primer嗎?? : 因為我的實驗其實已經快結束了...如果我之前的primer量真的加的太少， : 那我可能所有實驗要重做了....orz : 所以我想請問各位有經驗的大大，有人也是和我一樣，用類似的量做real-time PCR的嗎 : PS，我用的kit是 SYBR的kit -- 幸運是每個人都會有的, 但幸福只給予一直不停追求著的人。 --

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