※ [本文转录自 Bioindustry 看板] 作者: frela (漫步北台湾) 看板: Bioindustry 标题: Re: [问题] 关於real-time PCR的问题 时间: Tue Mar 25 23:10:33 2008 您好,我是某公司的产品专员, 根据敝公司的SYBR Green supermix KIT标准操作手册中指出, primer的终浓度一般最好是介於100~500 nM 左右 而您文中之意是贵老师认为最好终浓度在500 nM 而您"不小心"只用了终浓度50 nM 基本上,若不考虑不同产品的优劣性... 您用的量,"会不会太少?" 这个问题...我想很少人可以回答,因为不同的检体或样本 都有可能有其最佳的条件存在,primer也是一个需要考量的条件, (比如说primer 的浓度低,是可以有效降低primer dimer的问题... 不过这是不得已的解决办法...) 关键在於一般像QPCR这种相当敏感的实验来说.. 您的positive control及negative control能不能有效证明您的实验是合理的, 才是重点! 如果之前没有设定的话 您就重新各设定一个positive control及negative control来证明... 若依我不负责任的说法...我倒觉得根本没差多少,只是最低浓度的二分之一? 论文中明确着明方法即可... ※ 引述《candy315 (沉淀)》之铭言： : 各位大大好，我是某大学的硕士生 : 我想请教关於real-time PCR的问题 : 大部份的实验...都会用RNA转cDNA然後再做real-time PCR : 但我的template是genomic DNA : 也有听说genomic DNA的real-time比较不好做.. : 然後，一个大问题来了 : 我们老板说，primer的量通常是总体积的1/10左右 : 所以我先用一般PCR在测试primer时，我是用5uM的primer，然後每管取2.5ul : (total volumn为25ul) : 但做real-time时，因为我阴错阳差的失误 : 一直以来，我都是用5um的primer，然後每管加0.25ul : (total volumn亦为25ul) : 我想请问大家，有人用过这麽少量的primer吗?? : 因为我的实验其实已经快结束了...如果我之前的primer量真的加的太少， : 那我可能所有实验要重做了....orz : 所以我想请问各位有经验的大大，有人也是和我一样，用类似的量做real-time PCR的吗 : PS，我用的kit是 SYBR的kit -- 幸运是每个人都会有的, 但幸福只给予一直不停追求着的人。 --

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