作者cytospin (My Ernest)
看板Biotech
標題[求救] EMSA 的基礎問題
時間Thu Jan 17 13:13:30 2008
最近要幫lab的其他研究生做EMSA 因為他一直做不出來
老師已經失去耐性了
我之前也沒有做過 這兩天在研究potocol
想請教一下大家的意見
首先dsDNA 我看古人的設計只有25bp (之前的postdoc看paper做的)
請公司替我們label biotin之後泡成400uM的濃度
問過隔壁lab的人 他們告訴我就用40 nM forward 50 ul + 40nM reverse 50 ul
所以這樣我的final 濃度就是20nM (這樣對嗎??)
上面蓋上礦物oil 然後放在一個兩L的水中加熱
水滾了之後兩分鐘 讓他自然冷卻 O/N
pierce上面建議biotin-labled DNA放4fmoles
所以我就是20nM放 2 ul 就應該會是4fmoles
我的疑問是
大部分的核蛋白都是放多少阿
蛋白和DNA的比例到底是如何制定出來的??
還有古人設計的25 bp會部會太小了一點阿 會有什麼二集結構的問題嗎??
我看上面還有很多optimal用的reagents
我是想說先至少看到band再說
請有經驗的大大分享一下經驗
有關於DNA vs protein的比例
想要第一次就做成功阿......
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 75.185.92.118
1F：推 hosaile:我自己的經驗是核蛋白的量要做過測試才知道最適合的量 01/17 21:00
2F：→ hosaile:每個protein對上不同sequence的結合能力本來就不同 01/17 21:00
3F：→ hosaile:不過我第一次試的時候放的量分別是 1ug, 3ug, 5ug, 10ug 01/17 21:02
4F：→ hosaile:給你做參考 祝你實驗順利囉 01/17 21:03
5F：→ hosaile:喔對了 我想DNA那麼短是不太可能出現二級結構啦 01/17 21:04
6F：→ hosaile:就算有的話 佔所有probe中的量一定也很少 反正不會被bind 01/17 21:05
7F：→ hosaile:所以不用擔心囉! 01/17 21:06
8F：推 viroid:Oligo的大小通常最高可以到70bp 01/18 10:33
9F：→ viroid:但是oligo太長，就必須要用HPLC純化，會貴很多 01/18 10:33
10F：→ viroid:不然就是要自己跑膠純化 01/18 10:34
11F：→ viroid:此外 probe越長，可能會有不只一個蛋白質跟DNA結合 01/18 10:34
12F：→ viroid:如果不是oligo，而是用DNA fragmet當probe，最長可以到250b 01/18 10:37
13F：→ viroid:更長就會因為太多protein binding而很難得到什麼資訊 01/18 10:38