作者cytospin (My Ernest)
看板Biotech
标题[求救] EMSA 的基础问题
时间Thu Jan 17 13:13:30 2008
最近要帮lab的其他研究生做EMSA 因为他一直做不出来
老师已经失去耐性了
我之前也没有做过 这两天在研究potocol
想请教一下大家的意见
首先dsDNA 我看古人的设计只有25bp (之前的postdoc看paper做的)
请公司替我们label biotin之後泡成400uM的浓度
问过隔壁lab的人 他们告诉我就用40 nM forward 50 ul + 40nM reverse 50 ul
所以这样我的final 浓度就是20nM (这样对吗??)
上面盖上矿物oil 然後放在一个两L的水中加热
水滚了之後两分钟 让他自然冷却 O/N
pierce上面建议biotin-labled DNA放4fmoles
所以我就是20nM放 2 ul 就应该会是4fmoles
我的疑问是
大部分的核蛋白都是放多少阿
蛋白和DNA的比例到底是如何制定出来的??
还有古人设计的25 bp会部会太小了一点阿 会有什麽二集结构的问题吗??
我看上面还有很多optimal用的reagents
我是想说先至少看到band再说
请有经验的大大分享一下经验
有关於DNA vs protein的比例
想要第一次就做成功阿......
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 75.185.92.118
1F：推 hosaile:我自己的经验是核蛋白的量要做过测试才知道最适合的量 01/17 21:00
2F：→ hosaile:每个protein对上不同sequence的结合能力本来就不同 01/17 21:00
3F：→ hosaile:不过我第一次试的时候放的量分别是 1ug, 3ug, 5ug, 10ug 01/17 21:02
4F：→ hosaile:给你做参考 祝你实验顺利罗 01/17 21:03
5F：→ hosaile:喔对了 我想DNA那麽短是不太可能出现二级结构啦 01/17 21:04
6F：→ hosaile:就算有的话 占所有probe中的量一定也很少 反正不会被bind 01/17 21:05
7F：→ hosaile:所以不用担心罗! 01/17 21:06
8F：推 viroid:Oligo的大小通常最高可以到70bp 01/18 10:33
9F：→ viroid:但是oligo太长，就必须要用HPLC纯化，会贵很多 01/18 10:33
10F：→ viroid:不然就是要自己跑胶纯化 01/18 10:34
11F：→ viroid:此外 probe越长，可能会有不只一个蛋白质跟DNA结合 01/18 10:34
12F：→ viroid:如果不是oligo，而是用DNA fragmet当probe，最长可以到250b 01/18 10:37
13F：→ viroid:更长就会因为太多protein binding而很难得到什麽资讯 01/18 10:38