作者njp13 (.....)
看板Biotech
標題[求救] Plasmid抽出來以後 不久後卻消失了？
時間Fri Nov 30 19:53:47 2007
小弟最近在進行cloning
養完菌以後 作plasmid extraction
第一次
把抽出來的plasmid直接跑膠發現band很亮 濃度應該OK
接著把抽出來的plasmid切一刀
與空vector及之前insert正確size片段但有點突變的plasmid也切一刀之後比對大小
發現size也正確
接下來的應該就是送去定序
但是到定序商手上 他們測完OD發現我送的sample濃度太低
幾乎跟水沒兩樣
我想說那就再養一次再抽一次吧
第二次
我一樣先跑膠
band很亮
隔天測OD稀釋20倍得到的值卻只有0.0162 也就是說原始濃度只有 0.0162 μg/μl
(老實說這樣的值根本不可能出現前一天那麼亮的band)
不過我想應該定序商的機器還是可以讀得到
再隔一天
定序商來電 一樣 又是sample濃度太低
我發現我的plasmid濃度好像會衰退
不知道實驗經驗豐富的各位可以幫我想想為什麼有這樣的狀況發生嗎？
感謝感謝
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抱怨....
本身不是分生背景 碩一也不是作這方面的題目
因為老闆要被fire才換老闆換題目
現在碩二了 實驗進度龜慢 又一直卡到陰
不是跟Novagen這種大公司買vector結果送來的一管空的eppendorf
裡面什麼都沒有(一隻八千的eppendorf是鑲金的嗎？)
就是買到有問題的plasmid extraction kit
column一直破 結果才承認QC有問題 送一堆新的column補償
現在又遇到plasmid被鬼摸走的狀況
T＿T
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 61.217.31.18
1F：推 bluecsky:ㄟ..你抽plasmid最後回溶於什麼?TE?水? 11/30 19:59
2F：→ bluecsky:我以前遇過一種很囧的狀況..我回溶的水似乎有污染 11/30 20:01
3F：→ bluecsky:結果我的plasmid都被切成碎碎的小片段..= = 11/30 20:02
4F：→ bluecsky:後來換過水就好了..還有你說跑gel很亮?..能拿張圖來看嗎 11/30 20:02
5F：→ bluecsky:要是真的濃度低很簡單阿..多抽幾管給他濃縮就好XD 11/30 20:03
6F：→ bluecsky:可是有時候把DNA送太濃給人定序反而跑的結果很糟= = 11/30 20:04
7F：→ bluecsky:此外你一次跑gel都load多少plasmid去跑? 11/30 20:05
8F：推 njp13:最後回溶在KIT附的EB, 我猜可能是EB被污染掛點了... 11/30 20:23
10F：→ njp13:不只隔天測到的OD回推的值.. 11/30 20:29
11F：推 rebirth:題外話 定序不是可以直接送plate? 11/30 20:31
12F：推 njp13:恩恩 剛剛接到電話 定序公司說不然直接給他們菌液也可以 11/30 20:32
13F：→ njp13:我不知道可以直接送菌液或plate耶..哈 真是虛 11/30 20:32
14F：→ njp13:感謝b大跟r大的意見 謝謝你們 11/30 20:34
15F：推 bluecsky:哈..說老實話這種濃度其實不算高阿XD..直接送菌液吧 11/30 20:46
16F：推 satasumi:濃度真的不夠高耶,如果想要好的結果,至少要有100ng以上 11/30 20:56
17F：→ satasumi:而且.量要夠才行,不然品質會很差的 11/30 20:58
18F：推 njp13:恩 測完OD 我也是抱著姑且一試的心態送去定序，沒想到送到他 11/30 21:03
19F：→ njp13:們手裡的時候濃度已經降到缺近於零 XD 重作繼續作吧! 11/30 21:04
20F：推 bluehttp:加油 我最近也在作cloning 11/30 22:45
21F：推 meiosisLin:solution可能要換一下～～污染的可能性不小... 11/30 23:59
22F：推 wea:其實跑膠只要一點點就可以看得很清楚 12/04 16:18
23F：→ wea:OD260只有0.01多太低了 容易測不準 12/04 16:20
24F：→ wea:至於買來的vector 你確定管底真的沒有透明的一小片? 12/04 16:20
25F：推 njp13:真的沒有 因為後來送來新的一管是液態的...XD 我一開始也以 12/05 17:22
26F：→ njp13:為是要回溶 結果根本不是這樣 因為他附了一管control也是液 12/05 17:22
27F：→ njp13:態的 根本不用回溶就可以用..所以....恩 12/05 17:23