作者yumei (愛自己最重要)
看板Biotech
標題Re: [求救] PCR,以前做的出來,現在做不出來了?
時間Thu Oct 25 15:45:33 2007
謝謝大家給的意見,
沒想到有這麼多人願意提供建議,真感動耶~
不過我還是做不出來Orz
目前的進度是:
我今天換了不同位置的primer
結果依然還是沒有產物(dNTP也拿了一支全新的,Taq及buffer同時試兩個不同牌子)
實驗室的學長幫我試過原先的primer
改過條件,也是不行
(之前忘了說,舊primer跑不出來後,我有重新合成一支新的)
總不能睜眼說瞎話,"我沒有陽性菌株>.<"
明明之前曾經定序是ok的呀Q_Q
現在的想法是,應該是抽DNA出了問題吧,
只是想破頭都搞不清楚...
用Kit抽也還是跑不出來...
我想還是請個道士來實驗室做個法好了Orz
※ 引述《yumei (愛自己最重要)》之銘言：
: 請教版上的PCR高手們,
: 我目前做的題目是關於細菌的基因,
: 我做的是陰性菌,目前在檢測細菌中是否帶有特定的基因,
: 這個實驗在今年二月做過一部份,結果良好,一切都沒問題,
: 因為之後收到更多的菌株,因此在九月時又重新進行此實驗
: 結果非常慘,再也跑不出來了!
: 連之前二月做的陽性菌株,現在也無法跑出我要的產物
: 原先懷疑是PCR的問題
: 所以目前試過3家dNTP,4家Taq,
: 調整過鎂離子濃渡由1.5mM試到2.5mM,結果連水都出現偽陽性
: 改變annealing的溫度下降2-4度
: 都無法再度amplify出正確產物,
: 後來又懷疑是否DNA有問題,
: 又重抽DNA兩三次
: (使用過phenol/chloroform/Isoamyl Alcohol的方法也試了用kit抽DNA)
: 還是沒辦法Orz
: 目前還沒試的,只剩下加DMSO了
: (等會就知道結果了T_T)
: 可是我二月時不加DMSO也可以跑出來呀~~~
: 有人可以再給我不同的建議嗎?
: 試了快兩個月了,再做不出來,我真的可以不用玩了Q_Q
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◆ From: 140.112.96.207
1F：推 HIbaby:所謂陽性菌 有其他的[標準品]嗎 比方說菌種中心的 10/25 16:23
2F：推 HIbaby:少了control 很難知道是那裡有問題 10/25 16:25
3F：推 transmore:不要抽DNA 直接把菌resuspend在水中 然後煮個5分鐘 10/25 16:50
4F：→ transmore:接著直接拿菌水去PCR試試看 加熱就可以把DNA煮出來了 10/25 16:51
5F：→ transmore:菌水只要有一點點濁 基本上就夠用了 10/25 16:52
6F：推 jjogp:像我一般做colony-PCR都是直接用牙籤挑一點點菌去做 10/25 17:30
7F：→ jjogp:PCR program前面再多個94度C 3~5分鐘的步驟破菌即可 10/25 17:32
8F：推 jjogp:前題我的菌是E. coli,PCR是來看transformation結果 10/25 17:37
9F：推 HIbaby:transformation的狀況質體copy數應該都比內部基因高很多. 10/25 18:10
10F：推 enisx:coloy PCR的話,如果用牙籤挑菌做不出來,可以改用黃Tip挑 10/27 10:36
11F：→ enisx:有時候是colony太小你沒挑到,乾脆用黃tip整顆挖起來 10/27 10:37
12F：→ enisx:另外,失敗的圖可以放上來讓大家看看,說不定可以看出原因囉! 10/27 10:38
13F：推 enisx:所謂的"陽性菌"DNA是保存在怎樣的環境?TE buffer比水存得久 10/27 10:43