作者yumei (爱自己最重要)
看板Biotech
标题Re: [求救] PCR,以前做的出来,现在做不出来了?
时间Thu Oct 25 15:45:33 2007
谢谢大家给的意见,
没想到有这麽多人愿意提供建议,真感动耶~
不过我还是做不出来Orz
目前的进度是:
我今天换了不同位置的primer
结果依然还是没有产物(dNTP也拿了一支全新的,Taq及buffer同时试两个不同牌子)
实验室的学长帮我试过原先的primer
改过条件,也是不行
(之前忘了说,旧primer跑不出来後,我有重新合成一支新的)
总不能睁眼说瞎话,"我没有阳性菌株>.<"
明明之前曾经定序是ok的呀Q_Q
现在的想法是,应该是抽DNA出了问题吧,
只是想破头都搞不清楚...
用Kit抽也还是跑不出来...
我想还是请个道士来实验室做个法好了Orz
※ 引述《yumei (爱自己最重要)》之铭言：
: 请教版上的PCR高手们,
: 我目前做的题目是关於细菌的基因,
: 我做的是阴性菌,目前在检测细菌中是否带有特定的基因,
: 这个实验在今年二月做过一部份,结果良好,一切都没问题,
: 因为之後收到更多的菌株,因此在九月时又重新进行此实验
: 结果非常惨,再也跑不出来了!
: 连之前二月做的阳性菌株,现在也无法跑出我要的产物
: 原先怀疑是PCR的问题
: 所以目前试过3家dNTP,4家Taq,
: 调整过镁离子浓渡由1.5mM试到2.5mM,结果连水都出现伪阳性
: 改变annealing的温度下降2-4度
: 都无法再度amplify出正确产物,
: 後来又怀疑是否DNA有问题,
: 又重抽DNA两三次
: (使用过phenol/chloroform/Isoamyl Alcohol的方法也试了用kit抽DNA)
: 还是没办法Orz
: 目前还没试的,只剩下加DMSO了
: (等会就知道结果了T_T)
: 可是我二月时不加DMSO也可以跑出来呀~~~
: 有人可以再给我不同的建议吗?
: 试了快两个月了,再做不出来,我真的可以不用玩了Q_Q
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◆ From: 140.112.96.207
1F：推 HIbaby:所谓阳性菌 有其他的[标准品]吗 比方说菌种中心的 10/25 16:23
2F：推 HIbaby:少了control 很难知道是那里有问题 10/25 16:25
3F：推 transmore:不要抽DNA 直接把菌resuspend在水中 然後煮个5分钟 10/25 16:50
4F：→ transmore:接着直接拿菌水去PCR试试看 加热就可以把DNA煮出来了 10/25 16:51
5F：→ transmore:菌水只要有一点点浊 基本上就够用了 10/25 16:52
6F：推 jjogp:像我一般做colony-PCR都是直接用牙签挑一点点菌去做 10/25 17:30
7F：→ jjogp:PCR program前面再多个94度C 3~5分钟的步骤破菌即可 10/25 17:32
8F：推 jjogp:前题我的菌是E. coli,PCR是来看transformation结果 10/25 17:37
9F：推 HIbaby:transformation的状况质体copy数应该都比内部基因高很多. 10/25 18:10
10F：推 enisx:coloy PCR的话,如果用牙签挑菌做不出来,可以改用黄Tip挑 10/27 10:36
11F：→ enisx:有时候是colony太小你没挑到,乾脆用黄tip整颗挖起来 10/27 10:37
12F：→ enisx:另外,失败的图可以放上来让大家看看,说不定可以看出原因罗! 10/27 10:38
13F：推 enisx:所谓的"阳性菌"DNA是保存在怎样的环境?TE buffer比水存得久 10/27 10:43