作者HIbaby (嗨北鼻)
看板Biotech
標題Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?
時間Sat Oct 20 10:00:34 2007
※ 引述《mojimoji (Tim)》之銘言：
:我CLONE了一個gene進去plasmid中
:不過因為是pcr product所以難免有mutation
:請問要如何利用點突變的方法把他改回來呢
:有沒有可以參考的文章 謝謝!
看到這一大串討論
提出我的做法
1. 請使用可以proof reading的polymerase來作
2. 如果是從A質體換到B質體 儘可能用切的
如果沒有適合的切位
我會想辦法 從 A 先換到 適合的 C 在從C 接回B
3. 萬一沒有template來源 也就是都要從 cDNA來增幅片段
那萬一這次發現mutation
請從PCR 步驟開始重作
因為同一批的PCR做出來的clone 可能mutantion的位置都一樣
最後再如板友所說 用切跟接
如果長度太長 就分段增幅再接
4. 建議不要做point mutation方式修回 因為又要用到PCR步驟 有很多風險
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◆ From: 133.11.50.177
※ 編輯: HIbaby 來自: 133.11.50.177 (10/20 10:04)
1F：推 transmore:推一個 10/20 13:14
2F：推 leondemon:推第三點 很受用唷～ 10/20 13:42
3F：推 blence:第三點,理論上同樣一批做的clone有同樣的mutation,那就該懷 10/20 14:48
4F：→ blence:疑cDNA或template本來就是有問題了,因為要來的,買來的EST 10/20 14:50
5F：→ blence:clones,甚至自己做的細胞株cDNA,跟database總是有可能不一 10/20 14:56
6F：推 HIbaby:是的 blence大說得我也遇過 甚至很多位置都有差異性 10/20 16:11
7F：推 HIbaby:不過可能是生物品系不同所影響的 還是得檢討才行. 10/20 16:12