作者HIbaby (嗨北鼻)
看板Biotech
标题Re: [方法] 如何对plasmid做site-directed mutation ?
时间Sat Oct 20 10:00:34 2007
※ 引述《mojimoji (Tim)》之铭言：
:我CLONE了一个gene进去plasmid中
:不过因为是pcr product所以难免有mutation
:请问要如何利用点突变的方法把他改回来呢
:有没有可以参考的文章 谢谢!
看到这一大串讨论
提出我的做法
1. 请使用可以proof reading的polymerase来作
2. 如果是从A质体换到B质体 尽可能用切的
如果没有适合的切位
我会想办法 从 A 先换到 适合的 C 在从C 接回B
3. 万一没有template来源 也就是都要从 cDNA来增幅片段
那万一这次发现mutation
请从PCR 步骤开始重作
因为同一批的PCR做出来的clone 可能mutantion的位置都一样
最後再如板友所说 用切跟接
如果长度太长 就分段增幅再接
4. 建议不要做point mutation方式修回 因为又要用到PCR步骤 有很多风险
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◆ From: 133.11.50.177
※ 编辑: HIbaby 来自: 133.11.50.177 (10/20 10:04)
1F：推 transmore:推一个 10/20 13:14
2F：推 leondemon:推第三点 很受用唷～ 10/20 13:42
3F：推 blence:第三点,理论上同样一批做的clone有同样的mutation,那就该怀 10/20 14:48
4F：→ blence:疑cDNA或template本来就是有问题了,因为要来的,买来的EST 10/20 14:50
5F：→ blence:clones,甚至自己做的细胞株cDNA,跟database总是有可能不一 10/20 14:56
6F：推 HIbaby:是的 blence大说得我也遇过 甚至很多位置都有差异性 10/20 16:11
7F：推 HIbaby:不过可能是生物品系不同所影响的 还是得检讨才行. 10/20 16:12