※裡面吃掉 methylated template 似乎也可以交給 DpnI, 如果沒有特殊菌株的話... ) : 是比較建議: : 1. 確認 template 來源單一. 比如說拿來 PCR 的 template 重新畫開挑 : single colony 抽 plasmid 用來做為重新 PCR 的 template. : 2. 確認實驗的目的, 烏鴉不清楚你要 clone 的 gene 為什麼要重新 PCR, : 所以下面只是猜測... 如果說是因為 cutting site 的問題, 要做不一樣的 : cutting site 好進行 sub cloning, 那建議可以只 PCR 前面一小段, : 然後接回去舊的 vector 後再整段剪下來去進行 sub clone... : 3. 如果排除了烏鴉上面可能的猜測, 非得整段進行 PCR 不可, : 那可以... : 3A. 重新 PCR, 重新接, 瘋狂送 Sequence... : 3B. 檢查之前送定序結果的東西在 mutant 附近有沒有 cutting site 可以 : 進行剪接, 看看那麼多 sample 之中有沒有可以用來互相彌補的. : 如果為了老闆要拼業績, 這是可以與 3A 同步進行的. : 3C. 不顧一切的去訂 primer, 用 site-directed mutation 的方法一個個改回來... : 當然, 烏鴉也是比較不建議 3C 的... 我現在的想法是分段做pcr然後再接起來 畢竟越短的錯誤機率越低 可是還沒想到要怎麼分段做 兩個pcr片段可以直接接起來嗎？(先變成一個大的insert)甚至多個接成長片段 再一起接到vector中 感覺起來就算可行 efficiency也超低 瘋狂送 Sequence我會被砍死啦！ --

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