作者driws (自由 呼吸 存在)
看板Biotech
標題Re: [問題] 向中研院購買的shRNA
時間Fri Oct 5 00:02:21 2007
※ 引述《driws (自由 呼吸 存在)》之銘言：
抽向中研院購買的shRNA的plasmid是否有特殊的技巧?
我用Quiegen的mini prep kit抽了好幾次
養小量抽3 c.c菌液最後用30 uL的水去elute
但幾乎出抽不出來...濃度低到只有0.05~0.06 ug/ul
過程十分小心
260/280的比值竟然高到3甚至4
以前抽plasmid從來沒有過這樣的問題
請問有經驗的前輩該如何改進 謝謝回答
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◆ From: 140.116.60.163
1F：推 mandible:寫信去RNAi cortism問! 10/02 13:29
2F：推 ymme:你是用TB養嗎 10/02 13:45
3F：推 hal:這個shRNA的菌好像都長的特別慢就連塗plate時也是長超小 10/02 14:00
4F：→ hal:所以養的時間比較久才會抽的比較多 我用LB 5ml 養20小時吧 10/02 14:03
5F：推 driws:我是用LB養 我塗plate的時候長的很小顆但是很多 塗太多嗎? 10/02 15:15
6F：→ driws:所以養小量要抽到5 c.c 才會有正常的濃度囉... 10/02 15:17
7F：推 ruthwu:要用TB以300rpm養17-19小時,建議值是3倍稀釋OD600=0.4-0.6 10/02 18:29
8F：→ ruthwu:我是抽5ml,回溶20ul 10/02 18:32
9F：推 milkpa:如果是low copy的plasmid就會較少量，長度較長可加熱再elut 10/02 22:34
謝謝大家的意見 :)
我後來又挑了五個clone養下去
今天抽小量順利的抽出來了三個clone
260/280都在1.9上下 濃度也有0.4了
參考大家的意見以及實驗室現有資源的考量下
我最後採用的方式是
用LB 250rpm養14~15個小時抽5c.c最後以70度的熱水30 ul elute
如果可以用TB的效果一定更好 當初買來就是這麼建議的
但是礙於實驗室沒有 老師也不是很有購買的意願...
另外不知道為什麼
我養20個小時相對於15小時 同樣5 c.c抽起來的反而比較不好
有學姊跟我說可能是因為這個vector很大 大約有6K
養的太老 E.coli 會傾向把這個外來的plasmid推出去所以會比較差一點
不過依舊是比原來的condition好多了
再次感謝~
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◆ From: 211.74.96.252
※ 編輯: driws 來自: 211.74.96.252 (10/05 00:03)
※ 編輯: driws 來自: 211.74.96.252 (10/05 00:04)
10F：推 Liat:實驗室沒有TB的意思是沒有現成配好的TB配方嗎？假如有那些材 10/05 00:46
11F：→ Liat:料，可以自己配製呀！適用的medium可使你事半功倍～ 10/05 00:47
12F：推 SECIA:plate用LB可 長菌要用TB PLASMID quality才會好 10/05 23:03