作者driws (自由 呼吸 存在)
看板Biotech
标题Re: [问题] 向中研院购买的shRNA
时间Fri Oct 5 00:02:21 2007
※ 引述《driws (自由 呼吸 存在)》之铭言：
抽向中研院购买的shRNA的plasmid是否有特殊的技巧?
我用Quiegen的mini prep kit抽了好几次
养小量抽3 c.c菌液最後用30 uL的水去elute
但几乎出抽不出来...浓度低到只有0.05~0.06 ug/ul
过程十分小心
260/280的比值竟然高到3甚至4
以前抽plasmid从来没有过这样的问题
请问有经验的前辈该如何改进 谢谢回答
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◆ From: 140.116.60.163
1F：推 mandible:写信去RNAi cortism问! 10/02 13:29
2F：推 ymme:你是用TB养吗 10/02 13:45
3F：推 hal:这个shRNA的菌好像都长的特别慢就连涂plate时也是长超小 10/02 14:00
4F：→ hal:所以养的时间比较久才会抽的比较多 我用LB 5ml 养20小时吧 10/02 14:03
5F：推 driws:我是用LB养 我涂plate的时候长的很小颗但是很多 涂太多吗? 10/02 15:15
6F：→ driws:所以养小量要抽到5 c.c 才会有正常的浓度罗... 10/02 15:17
7F：推 ruthwu:要用TB以300rpm养17-19小时,建议值是3倍稀释OD600=0.4-0.6 10/02 18:29
8F：→ ruthwu:我是抽5ml,回溶20ul 10/02 18:32
9F：推 milkpa:如果是low copy的plasmid就会较少量，长度较长可加热再elut 10/02 22:34
谢谢大家的意见 :)
我後来又挑了五个clone养下去
今天抽小量顺利的抽出来了三个clone
260/280都在1.9上下 浓度也有0.4了
参考大家的意见以及实验室现有资源的考量下
我最後采用的方式是
用LB 250rpm养14~15个小时抽5c.c最後以70度的热水30 ul elute
如果可以用TB的效果一定更好 当初买来就是这麽建议的
但是碍於实验室没有 老师也不是很有购买的意愿...
另外不知道为什麽
我养20个小时相对於15小时 同样5 c.c抽起来的反而比较不好
有学姊跟我说可能是因为这个vector很大 大约有6K
养的太老 E.coli 会倾向把这个外来的plasmid推出去所以会比较差一点
不过依旧是比原来的condition好多了
再次感谢~
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◆ From: 211.74.96.252
※ 编辑: driws 来自: 211.74.96.252 (10/05 00:03)
※ 编辑: driws 来自: 211.74.96.252 (10/05 00:04)
10F：推 Liat:实验室没有TB的意思是没有现成配好的TB配方吗？假如有那些材 10/05 00:46
11F：→ Liat:料，可以自己配制呀！适用的medium可使你事半功倍～ 10/05 00:47
12F：推 SECIA:plate用LB可 长菌要用TB PLASMID quality才会好 10/05 23:03