作者bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)
看板Biotech
標題[求救] 有關蛋白質純化..
時間Sun Sep 16 20:00:36 2007
我使用的是QIAGEN PQE30這各vector
6個his-tag是在n-termial
host是M15這株e.coli
目標的蛋白質大小(加上his-tag以及前端)約為42KD
對過序列..reading frame沒有問題
在使用37度下, 1mM IPTG誘導後
在大約4x的位置有看到一個明顯的band
之後使用QIAGEN手冊上的方法去鑑定可溶性
確定存在soluble fraction中
接者我使用Ni-NTA agarose去和soluble fraction混合(在native condiction)
再根據手冊上的流程去做wash跟elution..
但是問題來了..
第一個..我在第一段binding remain的地方發現到
我目標的那些protein幾乎都沒有跟Ni-NTA bind
之後也都是空空沒有任何東西了..
這是我的lysis buffer的問題嘛?還是我使用的Ni-NTA有問題?
還是我根本就沒誘導出我的protein?
將lysis buffer中的imidazole減少會改善這種狀況嗎?
還是必須使用denature的condiction呢?
(以前我使用安碼西亞的His trap spin column也是跑出同樣的結果..
目標protein根本沒有bind上去)
另外有另一個問題
我試過使用低溫(16度)加上0.1 mM的IPTG去誘導過
結果出現了兩個band都明顯變粗及顏色變深
其中一個大約在4x KD的位置..另一個約在6X KD的位置
這樣是有可能的嗎?這樣的結果還能拿去做純化嗎?
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啊！我們真的是拼圖(喘)
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.137.56.252
※ 編輯: bluecsky 來自: 220.137.56.252 (09/16 20:02)
1F：→ runpapa0520:你純化前有用WESTERN確認嗎? 先看到底有沒有表現出 09/16 20:15
2F：→ bluecsky:沒有抗體怎麼做western...囧 09/16 20:18
3F：→ bluecsky:還是R大的意思是說抓his-tag的抗體?..有這種東西嗎? 09/16 20:19
4F：推 runpapa0520:你都接6his了 當然用ANTI-6his去確認看看摟 09/16 20:20
5F：推 bluecsky:原來如此阿..那去找找有沒有相對應的anti-body.. 09/16 20:21
6F：→ runpapa0520:很多家都有賣，隨便問問都有，GE也有。先確認有再純化 09/16 20:21
7F：→ bluecsky:了解..不然這樣盲目的搞下去也不知道何時能了..= = 09/16 20:23
8F：→ bluecsky:不過我的目標protein是一個transmembrane protein.. 09/16 20:24
9F：→ bluecsky:會比較難以誘導或是純化嗎? 09/16 20:24
10F：推 runpapa0520:膜蛋白不好說ㄟ 看運氣!參考:誘導表現蛋白質 討論串 09/16 22:03
11F：推 pizzicato:請問你lysis buffer中 imidazole濃度多少？ 09/18 22:28
12F：→ pizzicato:8mM 上下還OK...再多可能會影響 column binding 09/18 22:28
13F：推 bluecsky:跟據QIAGEN的手冊配的..lysis buffer中有10mM的imidazole 09/19 00:36