作者bluecsky (我要蓝蓝淡淡的天空)
看板Biotech
标题[求救] 有关蛋白质纯化..
时间Sun Sep 16 20:00:36 2007
我使用的是QIAGEN PQE30这各vector
6个his-tag是在n-termial
host是M15这株e.coli
目标的蛋白质大小(加上his-tag以及前端)约为42KD
对过序列..reading frame没有问题
在使用37度下, 1mM IPTG诱导後
在大约4x的位置有看到一个明显的band
之後使用QIAGEN手册上的方法去监定可溶性
确定存在soluble fraction中
接者我使用Ni-NTA agarose去和soluble fraction混合(在native condiction)
再根据手册上的流程去做wash跟elution..
但是问题来了..
第一个..我在第一段binding remain的地方发现到
我目标的那些protein几乎都没有跟Ni-NTA bind
之後也都是空空没有任何东西了..
这是我的lysis buffer的问题嘛?还是我使用的Ni-NTA有问题?
还是我根本就没诱导出我的protein?
将lysis buffer中的imidazole减少会改善这种状况吗?
还是必须使用denature的condiction呢?
(以前我使用安码西亚的His trap spin column也是跑出同样的结果..
目标protein根本没有bind上去)
另外有另一个问题
我试过使用低温(16度)加上0.1 mM的IPTG去诱导过
结果出现了两个band都明显变粗及颜色变深
其中一个大约在4x KD的位置..另一个约在6X KD的位置
这样是有可能的吗?这样的结果还能拿去做纯化吗?
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啊！我们真的是拼图(喘)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.137.56.252
※ 编辑: bluecsky 来自: 220.137.56.252 (09/16 20:02)
1F：→ runpapa0520:你纯化前有用WESTERN确认吗? 先看到底有没有表现出 09/16 20:15
2F：→ bluecsky:没有抗体怎麽做western...囧 09/16 20:18
3F：→ bluecsky:还是R大的意思是说抓his-tag的抗体?..有这种东西吗? 09/16 20:19
4F：推 runpapa0520:你都接6his了 当然用ANTI-6his去确认看看搂 09/16 20:20
5F：推 bluecsky:原来如此阿..那去找找有没有相对应的anti-body.. 09/16 20:21
6F：→ runpapa0520:很多家都有卖，随便问问都有，GE也有。先确认有再纯化 09/16 20:21
7F：→ bluecsky:了解..不然这样盲目的搞下去也不知道何时能了..= = 09/16 20:23
8F：→ bluecsky:不过我的目标protein是一个transmembrane protein.. 09/16 20:24
9F：→ bluecsky:会比较难以诱导或是纯化吗? 09/16 20:24
10F：推 runpapa0520:膜蛋白不好说ㄟ 看运气!参考:诱导表现蛋白质 讨论串 09/16 22:03
11F：推 pizzicato:请问你lysis buffer中 imidazole浓度多少？ 09/18 22:28
12F：→ pizzicato:8mM 上下还OK...再多可能会影响 column binding 09/18 22:28
13F：推 bluecsky:跟据QIAGEN的手册配的..lysis buffer中有10mM的imidazole 09/19 00:36