※ 引述《mournermind (阿矇)》之銘言： : 我們實驗室長久以來的方法大概就是 : 1. single colony -> 養12hr以上 OD600約1.XX : 2. 以約1/10的菌液加入新鮮LB中 OD600約0.1 進行refresh : 3. 約2~3hr後 OD600 約0.5進行IPTG induce : 4. 取定點時間induced的菌看蛋白表現 : 可是我在pET mannual中所看到的方法大概是 : 1. single colony -> 養到 OD600約 0.5 : 2. 以3ml的菌液加入100ml新鮮LB中進行refresh : 3. 約2~3hr後 OD600 約0.5 ~ 1 進行IPTG induce : 4. 取定點時間induced的菌看蛋白表現 如果是我，一開始我會先試這個。你們實驗室的方法你可以有問題之後再試。 （或是通通試亦可。那就一次養兩瓶，一次搞定） : 以上我沒誤解應該是這樣 : 另外 : 我問其他家專門做蛋白的同學他跟我說 : 她們家老闆跟她們說菌液refresh後大概OD600要到0.8 : (反正就是快進入station phase) 個人的經驗亦是如此。 我的菌株在saturation state之後再轉1L LB亦表現良好… 不過我也想說，應該有可能是case by case. : 時讓菌達到快最大量時再進行IPTG induce會得到較多的產物 : 我現在有點迷糊掉了 不知道板上的其他學長姐所表現蛋白的條件會是怎樣?? : 另外因為我現在表現的蛋白是大部份不可溶但supernatent也表現出有產物的情況 : (SDS PAGE就可看出 不是很濃但比其他雜band強3倍以上) 依據你提供的資料，OD600nm=~ 1.0 will be better than 0.5. 不放心的話，用20mL or 50mL小量養，測試OD條件，以SDS-PAGE驗證。 : 我現在已經進行25度C的養菌 可是養了22hr了LB還是很澄清ˊˋ 這樣正常嗎 : (我的菌 lacI represser很像鎖不太緊即使不加IPTG也會表現 : 我在37度C養的這隻要表現的菌也會比一般的菌長的慢點) : 另外在進行低溫誘導時是否也是要在菌OD600到一定值後才加IPTG? usually.太早會導致菌很快樂，但沒有妳要的蛋白表現。 不過…在這邊看似忽妳的菌體質不太好。 如果實驗室有學長姊的話，拿他們的菌試試？（competent cell） : 還是一開始就可以加了??(不好意思問這種問題 因為實驗室學長姐要我自己 : try try看ˊˋ 可是我想問有經驗的比較快... ...) : 以上謝謝各位學長姐啦~ 參考看看 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 76.201.144.184