我是用Promega 的 pGEM-T easy Vector system 我要的片段在之前已經利用上面提到東西接起來了~3k vector+1k insert 現在要利用PCR~來換我insert兩端的切位~ 又因為~我的template是pGEM 所以為了防止transform後被原來的template干擾~ 我PCR完的產物~利用Gel-M~來做gel elution 才依Promega提供的那本小手冊的量去加入pGEM vector 混合好後~放在4度C overnight 隔天transform是用300λ的competent cell (TSS方法製成) 盤子上塗 Amp.(50mg/ml) 30λ + X-gal (4%)20λ + IPTG 15λ (100mM) 問題來了~~ 1.收盤子的時候 居然一盤只有不到五顆的colony 2.挑出來養~抽plasmid去跑膠~ 結果很神奇的是大約在2k左右的大小~ 我的盤子~看起來沒有長雜菌 所以理論上挑去養的~ 要不就是要在3k 要不就是要在3k+1k 和學長討論加上自己查一些資料的結果~ 已經討論出一些原因~ 1. ligation的效率不好~ 我去promega的網站查~它是說要在22度下16hr 可是promega的小冊子又說放在4度下overnight T4-ligase適合的工作溫度到底是多少呀~!? 之前在做cloning的時候~我是都放在16度的水浴 2. 學長說有可能Insert的量經過elution後變的太少 可是我在elution後~會習慣拿2λ去跑膠~ 經過我計算的結果~大約都還有60~45ng/λ 3. 神奇的2k(是很sharp的band喔) 目前還不知道它是什麼~ 另一個學長說有可能是我的competent cell被實驗室其他抗Amp的菌汙染了~ 可是我們實驗室~沒有2k抗Amp的plasmid呀~!? 4. Amp塗太多~!? 我目前設定的解決方式~~ 1. PCR的產物~在gel elution後~直接加限制酶去切~ overnight後~過PCR-M 直接接進我要用的pCAMBIA1304 2. 加入pGEM後~放在4度下讓它接兩天~ 3. 加入pGEM後~放在22度下讓它overnight ===== 大家可以幫我再想想問題可能出在哪嗎~!? 或是有什麼解決的方法~!? --

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