我是用Promega 的 pGEM-T easy Vector system 我要的片段在之前已经利用上面提到东西接起来了~3k vector+1k insert 现在要利用PCR~来换我insert两端的切位~ 又因为~我的template是pGEM 所以为了防止transform後被原来的template干扰~ 我PCR完的产物~利用Gel-M~来做gel elution 才依Promega提供的那本小手册的量去加入pGEM vector 混合好後~放在4度C overnight 隔天transform是用300λ的competent cell (TSS方法制成) 盘子上涂 Amp.(50mg/ml) 30λ + X-gal (4%)20λ + IPTG 15λ (100mM) 问题来了~~ 1.收盘子的时候 居然一盘只有不到五颗的colony 2.挑出来养~抽plasmid去跑胶~ 结果很神奇的是大约在2k左右的大小~ 我的盘子~看起来没有长杂菌 所以理论上挑去养的~ 要不就是要在3k 要不就是要在3k+1k 和学长讨论加上自己查一些资料的结果~ 已经讨论出一些原因~ 1. ligation的效率不好~ 我去promega的网站查~它是说要在22度下16hr 可是promega的小册子又说放在4度下overnight T4-ligase适合的工作温度到底是多少呀~!? 之前在做cloning的时候~我是都放在16度的水浴 2. 学长说有可能Insert的量经过elution後变的太少 可是我在elution後~会习惯拿2λ去跑胶~ 经过我计算的结果~大约都还有60~45ng/λ 3. 神奇的2k(是很sharp的band喔) 目前还不知道它是什麽~ 另一个学长说有可能是我的competent cell被实验室其他抗Amp的菌污染了~ 可是我们实验室~没有2k抗Amp的plasmid呀~!? 4. Amp涂太多~!? 我目前设定的解决方式~~ 1. PCR的产物~在gel elution後~直接加限制酶去切~ overnight後~过PCR-M 直接接进我要用的pCAMBIA1304 2. 加入pGEM後~放在4度下让它接两天~ 3. 加入pGEM後~放在22度下让它overnight ===== 大家可以帮我再想想问题可能出在哪吗~!? 或是有什麽解决的方法~!? --

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