前一陣子我才進實驗室 開始學做實驗 但是一開始就碰到無法解決的問題了 我想用primer在gDNA上夾出一段約4.5kb的片段 但是 試過了許多condition，總無法成功夾出要的片段 想在這邊請問大家 有甚麼更好的方法嗎？ PCR condition如下： gDNA 1 ul 10X buffer 5 ul 10mM dNTP 2 ul primer-f 1 ul primer-r 1 ul PfuTaq 0.5 ul ddH20 39.5 ul -------------------------------- total 50 ul PCR cycle condition：(for genomic DNA) 95℃，2 min 95℃，30 sec 60℃，1 min 72℃，15 min (一般1kb算一分鐘，但用Pfu 時間要三倍) 3 cycles 95℃，30 sec 58℃，1 min 72℃，15 min 3 cycles 95℃，30 sec 54℃，1 min 72℃，15 min 26 cycles 72℃，7 min 4℃ forever -------------------------------- 上面那是我們實驗室標準的condition 我第一次PCR 沒成功後 把PfuTag改成ExTag 做第二次PCR 結果有成功做出約4.5kb的片段 第二次condition：除了把extension time改成5 min 其他條件和1st 實驗相同 接著拿去gel extraction 再稀釋7x 取1λ去跑PCR 此次用PfuTaq 第三次PCR cycle condition： Annealing 調降到57℃ (只有把第一次的condition 稍微修改一下) 結果 失敗！ 接著我再度把前次gel extraction 再稀釋7x的產物 拿去PCR PCR Condition 不改 PCR cycle condition有些微更動：(for plasmid) 95℃，2 min 95℃，30 sec 54℃，1 min 70℃，15 min 33 cycles 72℃，7 min 4℃， forever -------------------------------- 結果 仍然失敗！！ 第四次、第五次PCR 我開始用plasmid program (就是第三次PCR的program) 但是有更改一些條件 第四次： 第五次： 我把annealing 溫度改為53℃ 和第四次相同 Extension 溫度改為68℃ 和第四次相同 Extension time 改為 17 min Extension time 改為 12 min 跑33 cycles 和第四次相同 最後外加0.2λExTaq 和第四次相同 結果 仍失敗！！！ 最後一次 只是目前的最後一次…… 我稍微更改了plasmid program 把extension time 調為 20 min primer濃度調為1.5λ 跑40 cycles 結果 還是失敗啊！！！！ 請問大家 有成功用PfuTaq PCR出約4.5 kb的片段嗎？ 怎麼成功的呢？ 謝謝大家！！ --

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