前一阵子我才进实验室 开始学做实验 但是一开始就碰到无法解决的问题了 我想用primer在gDNA上夹出一段约4.5kb的片段 但是 试过了许多condition，总无法成功夹出要的片段 想在这边请问大家 有甚麽更好的方法吗？ PCR condition如下： gDNA 1 ul 10X buffer 5 ul 10mM dNTP 2 ul primer-f 1 ul primer-r 1 ul PfuTaq 0.5 ul ddH20 39.5 ul -------------------------------- total 50 ul PCR cycle condition：(for genomic DNA) 95℃，2 min 95℃，30 sec 60℃，1 min 72℃，15 min (一般1kb算一分钟，但用Pfu 时间要三倍) 3 cycles 95℃，30 sec 58℃，1 min 72℃，15 min 3 cycles 95℃，30 sec 54℃，1 min 72℃，15 min 26 cycles 72℃，7 min 4℃ forever -------------------------------- 上面那是我们实验室标准的condition 我第一次PCR 没成功後 把PfuTag改成ExTag 做第二次PCR 结果有成功做出约4.5kb的片段 第二次condition：除了把extension time改成5 min 其他条件和1st 实验相同 接着拿去gel extraction 再稀释7x 取1λ去跑PCR 此次用PfuTaq 第三次PCR cycle condition： Annealing 调降到57℃ (只有把第一次的condition 稍微修改一下) 结果 失败！ 接着我再度把前次gel extraction 再稀释7x的产物 拿去PCR PCR Condition 不改 PCR cycle condition有些微更动：(for plasmid) 95℃，2 min 95℃，30 sec 54℃，1 min 70℃，15 min 33 cycles 72℃，7 min 4℃， forever -------------------------------- 结果 仍然失败！！ 第四次、第五次PCR 我开始用plasmid program (就是第三次PCR的program) 但是有更改一些条件 第四次： 第五次： 我把annealing 温度改为53℃ 和第四次相同 Extension 温度改为68℃ 和第四次相同 Extension time 改为 17 min Extension time 改为 12 min 跑33 cycles 和第四次相同 最後外加0.2λExTaq 和第四次相同 结果 仍失败！！！ 最後一次 只是目前的最後一次…… 我稍微更改了plasmid program 把extension time 调为 20 min primer浓度调为1.5λ 跑40 cycles 结果 还是失败啊！！！！ 请问大家 有成功用PfuTaq PCR出约4.5 kb的片段吗？ 怎麽成功的呢？ 谢谢大家！！ --

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