作者scs0214 (睡覺去)
看板Biotech
標題[問題] EMSA
時間Thu Jul 26 14:03:23 2007
最近剛開始做EMSA的實驗
發現loading的sample 似乎都跑不下來 訊號大多在well 底部
以下是我的實驗條件
4% nondenature PAGE (37.5:1, acryl:bis) 1XTBE
loading sample: NE + isotope labeled probe(38bp) + poly dIdC
+ salmon DNA + buffer C
hot probe count: 28萬cpm/ul
NE: 6.7ug/ul
Lane1 是 不加NE 只有free probe
其他Lane 是分別做 固定NE 或 hot probe 作 titration (total 13ul)
loading 前有wash well 也有pre run 30min 200V , run gel 是200V 1小時10分
壓片的結果 有看到底部有free probe
但是lane 1 (No NE) 與其他lane 在well 底部都有很強的訊號
lane 1 的訊號是有比其他lane 弱
是否有可能是protein complex 太大 跑不下來 或是有其他的因素使protein
沉澱在well底部
麻煩有做過EMSA的前輩能給予改善的意見
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.253.121
1F：→ beowulfo:Buffer C的成分為何?? 07/26 14:08
2F：→ scs0214:20mM HEPES+25% glycerol+0.4M NaCl+1.5mM MaCl2 07/26 15:37
3F：→ scs0214:+ 0.2mMEDTA 07/26 15:41
4F：推 achihla:借這篇問一下~請問有人有比較過29:1和37.5:1的acrylamide 07/26 20:25
5F：→ achihla:跑出來有差異嗎? 07/26 20:27
6F：→ aggaci:妳如何確定是否真的有protein 結合在上面？ 07/26 21:01
7F：→ aggaci:EMSA實驗 well會有訊號的強弱差異是非常正常的 07/26 21:03
8F：推 elite1205:降低離子濃度 TBE濃度 V不要太大 well沖洗乾淨 07/26 23:40