作者scs0214 (睡觉去)
看板Biotech
标题[问题] EMSA
时间Thu Jul 26 14:03:23 2007
最近刚开始做EMSA的实验
发现loading的sample 似乎都跑不下来 讯号大多在well 底部
以下是我的实验条件
4% nondenature PAGE (37.5:1, acryl:bis) 1XTBE
loading sample: NE + isotope labeled probe(38bp) + poly dIdC
+ salmon DNA + buffer C
hot probe count: 28万cpm/ul
NE: 6.7ug/ul
Lane1 是 不加NE 只有free probe
其他Lane 是分别做 固定NE 或 hot probe 作 titration (total 13ul)
loading 前有wash well 也有pre run 30min 200V , run gel 是200V 1小时10分
压片的结果 有看到底部有free probe
但是lane 1 (No NE) 与其他lane 在well 底部都有很强的讯号
lane 1 的讯号是有比其他lane 弱
是否有可能是protein complex 太大 跑不下来 或是有其他的因素使protein
沉淀在well底部
麻烦有做过EMSA的前辈能给予改善的意见
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.253.121
1F：→ beowulfo:Buffer C的成分为何?? 07/26 14:08
2F：→ scs0214:20mM HEPES+25% glycerol+0.4M NaCl+1.5mM MaCl2 07/26 15:37
3F：→ scs0214:+ 0.2mMEDTA 07/26 15:41
4F：推 achihla:借这篇问一下~请问有人有比较过29:1和37.5:1的acrylamide 07/26 20:25
5F：→ achihla:跑出来有差异吗? 07/26 20:27
6F：→ aggaci:你如何确定是否真的有protein 结合在上面？ 07/26 21:01
7F：→ aggaci:EMSA实验 well会有讯号的强弱差异是非常正常的 07/26 21:03
8F：推 elite1205:降低离子浓度 TBE浓度 V不要太大 well冲洗乾净 07/26 23:40